Korzystając ze stron oraz aplikacji mobilnych Medycyny Praktycznej, wyrażasz zgodę na używanie cookies zgodnie z aktualnymi ustawieniami przeglądarki oraz zgodnie z polityką Medycyny Praktycznej dotyczącą plików cookies.
19 września 2014 roku
poczta
zaloguj się
 
medycyna praktyczna dla lekarzy
 

Genetyczne zróżnicowanie populacji - klucz do dziedziczności

Informacja genetyczna przechowywana jest w cząsteczkach DNA w postaci sekwencji nukleotydów. Możliwość dziedziczenia tylko jednej pary alleli w oczywisty sposób kłóci się z bezpośrednimi obserwacjami zmienności cech. Łatwa do pomiaru cecha fenotypowa, jaką jest wzrost dorosłego człowieka, to klasyczny przykład zmiennej o rozkładzie ciągłym, która może przyjąć dowolną wartość z pewnego przedziału.

Wynik pomiaru wzrostu, ciężaru ciała, ciśnienia tętniczego, stężenia określonej substancji w płynach ustrojowych itd. natrafia raczej na barierę dokładności metody niż na nieciągły rozkład wartości mierzonej cechy. Przy dostatecznie dużej liczbie zbadanych osób wyniki pomiarów skupiają się wokół wartości średniej, a krzywa częstości występowania cechy upodabnia się do teoretycznej opisanej funkcją nazywaną rozkładem normalnym (rys. 1).

Analizą dziedziczenia cech mierzalnych zajmuje się genetyka ilościowa. Gdyby Grzegorz Mendel próbował jedynie mierzyć wysokość swojego groszku, to zapewne prawa genetyki klasycznej, które odnoszą się do wyodrębnionych cech o charakterze jakościowym, czekałyby dłużej na swojego odkrywcę. Liczba łatwych do zbadania u człowieka cech fenotypowych, które są dziedziczone zgodnie z regułami opisanymi przez Mendla (cechy mendlowskie), jest niewielka.

Wystarczy zajrzeć do któregoś ze starszych podręczników medycyny, by sobie uświadomić, że jeszcze kilkadziesiąt lat temu cechy, których możliwość przekazania potomstwu zgodnie z prostymi regułami dziedziczenia zasługiwała na uwagę, rekrutowały się albo spośród rzadkich chorób, takich jak alkaptonuria i albinizm, albo spośród oznaczanych badaniami serologicznymi układów grupowych krwinek i białek krwi.

Obecnie liczba znanych cech mendlowskich sięga kilkunastu tysięcy. Od kilkudziesięciu lat katalogowaniem tych cech zajmuje się zespół naukowców kierowany przez Victora McKusicka z Uniwersytetu w Baltimore. Aktualna wersja Mendlowskiego Dziedziczenia Człowieka (Mendelian Inheritance in Men - MIM) jest ogólnie dostępna w sieci Internet (www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim).

Wnikliwa analiza rodowodów rodzin obciążonych chorobami dziedzicznymi wskazuje, że zdarzają się odstępstwa od prostych modeli dziedziczenia recesywnego, dominującego lub kodominującego (rys. 2).

Czasem choroba może się nie ujawnić u osoby, która ją odziedziczyła. Odsetek chorych spośród wszystkich osób dziedziczących nieprawidłowy allel nazwano penetracją cechy. Penetracja nieprawidłowego allelu może zależeć również od innych zmiennych, na przykład wieku i płci probanta (osoby, u której wykonuje się badanie genetyczne w ramach badania rodziny), stąd przy prowadzeniu bardziej złożonych obliczeń genetycznych z uwzględnieniem penetracji tworzone są tak zwane klasy podatności. Klasy podatności definiuje się przez dodatkowe, niedziedziczne kryteria; każdej klasie odpowiada określone prawdopodobieństwo ujawnienia choroby. Obraz kliniczny choroby u poszczególnych członków tej samej rodziny może być różnie nasilony; nasilenie nieprawidłowego fenotypu nazywamy ekspresją cechy. Wśród rodowodów odbiegających od modeli mendlowskich kilka typów, których mechanizmy molekularne wyjaśniono, zasługuje na bliższe przedstawienie.

Pewne rzadkie choroby dziedziczne, których przebieg charakteryzuje się upośledzeniem czynności ośrodkowego układu nerwowego, mogą się pojawiać w kolejnych generacjach tej samej rodziny z narastającą ekspresją (czyli coraz większym nasileniem). Analizę rodowodów tych chorych często utrudnia późna penetracja (czyli ujawnienie się) choroby. Szczególna właściwość tych chorób, która polega na cięższym przebiegu i wcześniejszej manifestacji u potomstwa chorego, jest nazywana antycypacją genetyczną.

Dystrofia miotoniczna Steinerta jest przykładem częstszej (1:10 000) choroby, której objawy mogą wystąpić już w wieku noworodkowym (wrodzona dystrofia miotoniczna). Tak wczesna i ciężka postać choroby zdarza się szczególnie wtedy, gdy chora matka już wcześniej urodziła dzieci chore na dystrofię miotoniczną. Analogiczne zjawisko obserwuje się w pląsawicy Huntingtona, w której antycypacja znacznie częściej występuje przy przekazywaniu nieprawidłowego allelu ojcowskiego.

Molekularny mechanizm wymienionych chorób, a także zespołu łamliwego chromosomu X (rys. 3) i jeszcze kilku rzadkich chorób neurodegeneracyjnych, polega na mutacjach w obrębie regionów genów o szczególnej strukturze.

Regiony te są zbudowane z powtórzeń trójnukleotydowych (np. CCG) i charakteryzują się brakiem stabilności, to znaczy częstymi mutacjami polegającymi na insercjach powtarzanego motywu trzech nukleotydów. Wiele spośród tych genów odpowiada za czynność neuronów. Stan, w którym allele zawierają kilkadziesiąt (np. 60) powtórzeń nukleotydowych, określa się mianem premutacji. W czasie replikacji genomu premutacje nasilają się przez zwiększenie liczby powtórzeń, niekiedy nawet do kilkuset (tzw. ekspansje trójnukleotydowe).

Mechanizm ekspansji trójnukleotydowych tłumaczy się "poślizgiem" polimerazy i ma związek z silną i nietypową konformacją regularnych powtórzeń sekwencji nukleotydów; możliwe jest również zjawisko nierównych wymian chromatyd siostrzanych. Zwiększanie liczby powtórzeń może dotyczyć w różnym stopniu komórek linii zarodkowej i komórek somatycznych. Jeśli ekspansja trójnukleotydowa dotyczy gamety, to choroba ujawnia się wcześniej, a jej przebieg jest cięższy, co wyjaśnia obserwowaną antycypację genetyczną.

Innym przykładem nietypowego dziedziczenia jest grupa chorób przenoszonych jedynie przez kobiety. W przeciwieństwie do cech sprzężonych z płcią - czyli z chromosomem X, nie obserwuje się w tych chorobach przekazania nieprawidłowego allelu od chorego ojca na córki. W modelu tym mężczyzna nie może w ogóle przekazać cechy choroby na potomstwo.

Przyczyną tak oczywistej dyskryminacji płci nie jest, jak w hemofilii, sprzężenie cechy z chromosomem X. Różnica ta nie była wcale tak oczywista, skoro w znanej od półtora tysiąca lat hemofilii możliwość przekazania choroby przez chorego mężczyznę za pośrednictwem córki dostrzeżono dopiero przed 87 laty. Geny takich chorób, jak atrofia nerwu wzrokowego Lebera, miopatie mitochondrialne i niektóre kwasice metaboliczne - mają swoje loci w pozajądrowym DNA mitochondriów (mtDNA).

W przypadku mutacji mtDNA obraz kliniczny choroby charakteryzuje duża zmienność. Komórka jajowa jest jedynym źródłem mitochondriów dla zygoty i zawiera ich ponad tysiąc. W przypadku nosicielstwa choroby przez matkę przypadkowa część mitochondriów oocytu ma zmutowane mtDNA; DNA pozostałych organelli jest prawidłowe; jest to tzw. heteroplazja. Rozmieszczenie zmutowanych mitochondriów w komórkach organizmu potomnego jest również dziełem przypadku. Dodatkowa zmienność efektów fenotypowych jest spowodowana manifestacją mutacji jedynie w przypadku jej obecności w komórkach o dużym zapotrzebowaniu energetycznym, takich jak układu nerwowego, mięśni i wątroby.

Najbardziej tajemniczy jest nadal taki model dziedziczenia, w którym zasadnicze znaczenie ma pochodzenie nieprawidłowego allelu. Geny pochodzenia ojcowskiego i matczynego nie są równocenne. Różnica między nimi polega na trwałym zablokowaniu ekspresji genetycznej poprzez metylację całych segmentów DNA w chromosomach pochodzących od jednego z rodziców.

Imprintingiem genetycznym, nazywanym czasem wpojeniem albo naznaczeniem, lub też piętnowaniem genomowym rodzicielskim, określa się brak ekspresji nieprawidłowego allelu, jeśli jest przekazywany przez osoby jednej płci. Mówi się zatem o imprintingu matczynym, jeżeli dzieci, które otrzymały gen choroby od matki, są zdrowe, natomiast choruje potomstwo jej brata.

Szczególnym przykładem imprintingu genetycznego są dwie choroby, które należą do tak zwanych zespołów dysmorficznych. Są to zespół Williego i Pradera oraz zespół Angelmana. Obie choroby rozpoznaje się już w wieku dziecięcym, a ich symptomatologia obejmuje opóźnienie rozwoju psychoruchowego. Geny obu chorób znajdują się w tym samym regionie długiego ramienia 15 chromosomu (15q11).

Zespół Angelmana w 75% przypadków spowodowany jest utratą matczynego fragmentu chromosomu 15 (delecja 15q11). Wśród nich do 6% stanowią mikrodelecje regionu odpowiedzialnego za utrzymanie aktywności matczynego chromosomu. W pozostałych przypadkach przyczyną choroby są inne mutacje, w tym mutacje punktowe genu ligazy białkowo-ubikwitynowej. Rzadką przyczyną zespołu Angelmana jest obecność dwóch ojcowskich kopii chromosomu 15 (izodisomiczność ojcowska) (rys. 4), spowodowana zaburzeniem podziału mejotycznego (nondysjunkcją).

W szczególnych rodzinach przemieszczenie fragmentów chromatyd (translokacja) między chromosomem 15 a innym autosomem jest przyczyną zaburzeń metylacji i prowadzi, jeśli taki chromosom przekazuje matka - do zespołu Angelmana lub, gdy translokowany chromosom pochodzi od ojca - do zespołu Williego i Pradera.

Konsekwencją każdego z wymienionych zaburzeń genetycznych w zespole Angelmana jest przypisanie choroby stracie matczynego materiału genetycznego; choroba nie może być przekazana (imprinting ojcowski) przez mężczyznę. Zespół Angelmana jest również interesujący z innego powodu. Jest to pierwsze odkryte zaburzenie szlaku degradacji białek spowodowane brakiem ligazy białkowo-ubikwitynowej. Enzym ten jest również pierwszym poznanym przykładem odmiennej ekspresji tkankowej allelu matczynego.

W zespole Williego i Pradera stwierdza się imprinting matczyny; choroba nie występuje, jeśli nieprawidłowy allel przekazała matka. Gen podlegający imprintingowi w zespole Williego i Pradera wykazuje ekspresję w ośrodkowym układzie nerwowym, a jego budowę charakteryzuje wielokrotne powtórzenie długich motywów nukleotydowych i skomplikowany mechanizm składania eksonów.

Dzięki badaniu cech dziedziczonych w sposób klasyczny gromadzone są dowody wskazujące na zmienność genetyczną populacji człowieka. Na zmienność tę składają się często (>1%) występujące (pospolite) warianty polimorficzne alleli oraz allele rzadkie (<1%). Historia poznania układów polimorficznych człowieka jest związana z rozwojem serologii, a współcześnie immunologii i gałęzi medycyny sądowo-lekarskiej - hemogenetyki.

Wiadomo już, że główny układ grupowy AB0, identyfikowany na podstawie odczynów aglutynacji krwinek czerwonych, kodowany jest przez locus transferazy glikozylowej na długim ramieniu chromosomu 9 (9q31.3). Spośród najczęstszych 4 alleli 3 kodują enzymy o odmiennej kinetyce (A1 i A2) i odmiennej zdolności rozpoznawania substratu (B). Allele te różnią się zaledwie kilkoma nukleotydami. Czwarty allel - 0, z powodu delecji jednego nukleotydu, ma przesuniętą ramkę odczytu i nie koduje aktywnego enzymatycznie białka.

Obecnie układy polimorficzne bada się najchętniej, wykorzystując techniki biologii molekularnej. W ciągu ostatniej dekady badanie polimorfizmu fragmentów restrykcyjnych (restriction fragments length polymorphism - RFLP) DNA, polegające na hybrydyzacji z sondą genetyczną w technice Southern blot, zastąpiono technikami wykorzystującymi amplifikacje PCR.

Wśród nich do najbardziej wydajnych należy badanie polimorfizmu powtórzeń wielokrotnych (variable number tandem repeats - VNTR). Powtórzenia krótkich motywów sekwencji DNA są rozproszone w całym genomie człowieka. Najliczniejsze z nich, dwunukleotydowe powtórzenia cytozyny i adeniny (CA), występują średnio co kilka tysięcy nukleotydów. W porównaniu z sąsiadującymi sekwencjami miejsce powtórzenia nukleotydowego może nieco częściej mutować. W toku ewolucji rozprzestrzeniły się w populacji warianty alleliczne zawierające od 4 do ponad 24 powtórzeń motywu CA. Należy podkreślić, że allele VNTR o zmienionej liczbie powtórzeń motywu nukleotydowego pojawiają się w drodze mutacji z częstością nieprzekraczającą ułamka procenta. W porównaniu z ogólną częstością mutacji DNA (1 zamiana na 10-7 kopiowanych nukleotydów) zjawisko to jest w obrębie powtórzeń wielokrotnych kilkaset razy częstsze.

Technika badania VNTR, nazywanych w przypadku powtórzeń CA także krótkimi powtórzeniami wielokrotnymi (short tandem repeats - STR) polega na amplifikacji fragmentu DNA, który zawiera powtórzenia. Startery takiej reakcji są komplementarne w stosunku do niezmiennych sekwencji oskrzydlających motyw powtórzeń, co gwarantuje swoistość badania (rys. 5). Określenie genotypu, czyli oznaczenie locus obu alleli (genotypowanie), odbywa się poprzez rozdział produktów amplifikacji na żelach do sekwencjonowania, których duża rozdzielczość pozwala na policzenie powtórzeń przez porównanie ze znanymi allelami wzorcowymi (tzw. drabinka alleli).

Na podstawie badania wielu układów STR i coraz liczniej poznawanych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (single nucleotide polymorphism - SNP) w materiale genetycznym pochodzącym od wielopokoleniowych, dużych rodzin powstają dokładne mapy genetyczne człowieka. Termin ten oznacza schemat uporządkowania miejsc genowych w obrębie chromosomów. Mapy fizyczne różnią się od map genetycznych tym, że ich konstrukcja jest oparta na długości fragmentów restrykcyjnych i sekwencjonowaniu DNA; skala map fizycznych to liczba par zasad dzielących geny. Mapy genetyczne porządkują geny w sposób orientacyjny, podając odległości w oparciu o przybliżoną miarę frakcji rekombinacji. Jedną z instytucji, które się zajmują gromadzeniem materiału genetycznego od ochotniczych rodzin w celu przeprowadzenia tego typu badań genomu, jest Centrum Badań Polimorfizmu Człowieka w Paryżu (Centre d'Etiude du Polymorphisme Humaine - CEPH).

Rzadkie allele nie wpływają w sposób istotny na zróżnicowanie genetyczne populacji człowieka. Zainteresowanie nimi spowodowane jest faktem, że wiele spośród rzadkich alleli jest przyczyną chorób wrodzonych. Najczęstsze allele recesywne w populacji to omówione już w poprzednim rozdziale mutacje genu CFTR, prowadzące do mukowiscydozy, oraz genu alfa-AT, powodujące niedobór alfa1-antytrypsyny.

Spośród innych warto wspomnieć o mutacjach hydroksylazy fenyloalaniny (fenyloketonuria), 21-hydroksylazy steroidowej (wrodzony przerost kory nadnerczy) i czynnika VIII krzepnięcia krwi (sprzężona z płcią hemofilia A). Wśród alleli dominujących powodujących choroby wrodzone wymienić należy mutacje receptora czynnika wzrostu fibroblastów (achondroplazja), neurofibrominy (choroba Recklinghausena) i kolagenu typu I (wrodzona łamliwość kości). Allele będące przyczyną tych chorób pojawiają się często wskutek nowej mutacji, która może być dalej przekazana potomstwu chorej osoby.

Genetyka rzadkich chorób i zespołów wrodzonych przetarła nowe szlaki w dziedzinie badania genomu człowieka. Przez wiele dziesięcioleci pragnienie niesienia pomocy rodzinom obciążonym chorobami dziedzicznymi było motorem nowych odkryć, zarówno technik badawczych, jak i genów.

Od kilku lat, kiedy lista brakujących genów odpowiedzialnych za rzadkie choroby dziedziczone w sposób prosty znacznie się skróciła, zainteresowania genetyków molekularnych obrały inny kierunek. Rozwiązanie zagadki determinacji tych cech fenotypowych, które charakteryzuje ciągły rozkład wielkości, intryguje genetyków od ponad 100 lat.

Podobnie jak było przy próbie zdefiniowania jednostki dziedziczenia, teoria matematyczna znacznie wyprzedziła w genetyce populacyjnej wiedzę empiryczną. Porównanie wykresów przedstawiających rozkład częstości cechy w populacji między jednogenowym modelem recesywnym a modelem wielogenowym sugeruje, że im więcej genów zaangażowanych jest w determinację cechy, tym bardziej jej rozkład jest zbliżony do rozkładu normalnego. Wielogenowość jest podstawową koncepcją objaśniającą dziedziczenie takich ilościowych cech fizjologicznych, jak wzrost, obwód głowy, inteligencja. Na podstawie tej koncepcji buduje się teorię ryzyka zachorowania na choroby nowotworowe, cukrzycę i miażdżycę.

Z praktyki lekarskiej wiadomo, że wymienione choroby często są poprzedzone typowymi czynnikami wyzwalającymi. Stany niedoboru witamin, ciężkie zakażenia, ekspozycje na czynniki szkodliwe mogą w istotny sposób modyfikować odziedziczone skłonności. Czynniki środowiskowe są zwane również czynnikami epigenetycznymi. Wielogenowe modele dziedziczenia, które uwzględniają efekt czynników środowiskowych, nazywa się modelami wieloczynnikowymi.

Ryzyko wystąpienia choroby dziedziczonej wieloczynnikowo jest - z braku lepszego sposobu - szacowane na podstawie retrospektywnej analizy rodowodów (ryzyko empiryczne). Jest ono zazwyczaj mniejsze od ryzyka spotykanego w klasycznych modelach dziedziczenia. Ryzyko empiryczne zależy również od stopnia nasilenia choroby oraz od liczby chorych w rodzinie (tab. 1.).

Choroba Krewni I stopnia Krewni II stopnia Krewni III stopnia Częstość w populacji
rozszczep wargi i(lub) podniebienia 4% 0,6% 0,3% 0,1%
rozszczep wargi i(lub) podniebienia u 2 dzieci 11% ryzyka dla następnego dziecka
rozszczep wargi i(lub) podniebienia u jednego z rodziców 11% ryzyka dla każdego z dzieci
zwężenie odźwiernika 2% 1% 0,4% 0,3%
zwężenie odźwiernika u chłopca 5% dla braci
2% dla sióstr
zwężenie odźwiernika u dziewczynki 17% dla braci
7% dla sióstr

Tab. 1. Częstość choroby dziedzicznej przy różnych stopniach pokrewieństwa i zmiany ryzyka jej wystąpienia zależne od obciążenia rodowodu

Badania rodzin, w których występuje choroba uwarunkowana genetycznie, mają zasadnicze znaczenie dla poznania jej patomechanizmu. Powodzenie tego typu badań zależy również od precyzyjnie ustalonych kryteriów diagnostycznych. Obiektywne trudności diagnostyczne oraz ewolucja systemów klasyfikacji leżą zapewne u źródeł niepowodzeń w dotychczasowych poszukiwaniach genów schizofrenii. Dla innej grupy chorób psychicznych - psychoz afektywnych, a także dla cukrzycy zasadnicze okazuje się przyjęcie wspólnego pochodzenia etnicznego badanych rodzin, wiele obserwacji nie znajduje bowiem potwierdzenia w odmiennych populacjach.

Najczęściej stosowaną i najstarszą techniką poszukiwania genów odpowiedzialnych za choroby jest ustalenie asocjacji genetycznych. Terminem tym określa się statystycznie istotne współwystępowanie analizowanej cechy fenotypowej z inną, dobrze już poznaną i najczęściej dziedziczoną w sposób mendlowski cechą, nazywaną markerem genetycznym. Pierwszymi markerami genetycznymi były proste do badania cechy, na przykład grupy krwi. Wśród rodzin, u których stwierdzano zmianę kształtu krwinek czerwonych, nazywaną eliptocytozą, wykazano w oparciu o badania grup krwi współwystępowanie tego defektu erytrocytów z cechą grupową krwi Duffy (Fy) (rys. 6).

Grupa krwi Duffy jest kodominującym układem dwuallelicznym. Na podstawie typowania z użyciem odpowiednich surowic można stwierdzić u osób posiadających ten układ grupowy jeden z 3 fenotypów (FyA, FyB lub FyAB). W każdej z badanych rodzin stwierdzano zawsze współwystępowanie eliptocytozy z cechą Fy. Po zbadaniu kilku rodzin okazało się, że związek ten dotyczy układu Duffy ogólnie, a nie tylko jednego z alleli, ponieważ osoby z eliptocytozą, w zależności od tego, do której rodziny należały, posiadały zawsze allel FyA albo FyB.

Tego typu asocjację genetyczną, w której nie stwierdza się współwystępowania cechy z jednym tylko allelem, ale udział miejsca genowego (locus), niezależnie od znajdujących się w nim alleli, nazywamy sprzężeniem genetycznym. Zjawisko sprzężenia genetycznego jest wynikiem sąsiedztwa loci genowych, które znajdują się na tej samej cząsteczce DNA, czyli na tym samym chromosomie (syntenia loci genowych).

Miarą oddalenia miejsc genowych jest parametr nazywany frakcją rekombinacji (theta). Dysponując rodowodami kilku rodzin, w których choroba wystąpiła co najmniej w dwóch generacjach i w których przeprowadzono badanie genotypu markera, można szybko oszacować frakcję rekombinacji. Odpowiada ona proporcji tych przypadków, w których nastąpiło naruszenie reguły sprzężenia, do ogólnej liczby analizowanych przypadków przekazania cechy z pokolenia na pokolenie.

W przypadku map genetycznych odległości między miejscami genowymi podaje się w centymorganach. Jednostka centymorgan odpowiada 1% frakcji rekombinacji. Orientacyjnie 1 centymorgan, czyli 1% rekombinacji, bywa przeliczany na fizyczną odległość 1 miliona par nukleotydowych, aczkolwiek relacja ta jest zachowana jedynie dla małych odległości genetycznych.

Warto podkreślić, że dla wartości theta = 0 sprzężenie jest tak silne (odległość loci tak mała), że brak stwierdzonej rekombinacji oznacza najczęściej alleliczność markerów, czyli ich wewnątrzgenowe położenie. Przeciwieństwem wspólnej segregacji blisko położonych genów jest segregacja przypadkowa. Maksymalna wartość theta przy zupełnym braku sprzężenia wynosi 0,5. W takim przypadku cecha choroby zostanie przekazana potomstwu wspólnie z każdym z alleli markera genetycznego w takiej samej liczbie.

Dla eliptocytozy i układu Duffy wykazano, że theta = 0,04. Przykład ten zasługuje na przypomnienie z tego powodu, że dotyczy pierwszego (w latach 1968-1977) przypisania grupy krwi do chromosomu człowieka (chromosom 1), oszacowania frakcji rekombinacji i pierwszej mapy genetycznej, zawierającej tylko 5 loci.

Na podstawie badania sprzężeń genetycznych między gęsto rozmieszczonymi w obrębie genomu człowieka markerami polimorficznymi możliwe jest poszukiwanie nieznanych loci chorób. Takie podejście badawcze nosi nazwę przesiewu całego genomu (total genome screening). Badanie przesiewowe całego genomu (genetyka genomowa) chętnie byłoby zastosowane przez wielu badaczy studiujących dziedziczenie chorób wieloczynnikowych.

Podstawową przeszkodą w jego stosowaniu jest znaczny koszt związany z wykonaniem dla każdej z badanych osób kompletu reakcji amplifikacji i rozdziału produktów na żelach o dużej rozdzielczości. Zmniejszenie kosztów tego typu badań wymaga zastąpienia znakowania izotopowego produktów amplifikacji użyciem biotyny lub barwników fluorescencyjnych. Stosowanie amplifikacji wielokrotnych i zastąpienie elektroforezy detekcją na macierzach oligonukleotydowych zwiastują dalsze rozpowszechnienie tej metody poszukiwania nieznanych genów.

Badanie przesiewowe genomu umożliwiło określenie regionów chromosomowych odpowiedzialnych za występowanie cukrzycy typu 2., atopii i nadreaktywności oskrzeli oraz niektórych chorób psychicznych. Należy jednak podkreślić, że siła badania sprzężeń genetycznych, zwłaszcza w przypadku przesiewu całego genomu, tkwi w stosunkowo łatwym wykluczaniu pewnych regionów chromosomowych. Podstawą wykluczenia jest stwierdzenie rekombinacji między miejscem genowym markera a domniemanym locus choroby.

Obliczenia komputerowe oparte na algorytmach optymalizacji podają wartość frakcji rekombinacji thetamax w badanych rodzinach na podstawie maksymalizacji wiarygodności (maximum likelihood estimates). W obliczeniach takich szacowane jest również prawdopodobieństwo przypadkowego napotkania stwierdzonego układu alleli, jeśli choroba nie byłaby sprzężona z markerem (czyli theta = 0,5). Iloraz tych szans może być małą liczbą ułamkową, w związku z tym przyjęto posługiwać się jego ujemnym logarytmem dziesiętnym (logarythm of odds ratio - LOD score), podobnie jak robią to chemicy ze stężeniem jonów wodorowych, podając pH.

Ujemne wartości LOD score występują w bezpośrednim sąsiedztwie loci tych markerów, dla których stwierdzono zerwanie sprzężenia z cechą choroby na podstawie rekombinacji. W celu potwierdzenia lokalizacji miejsca genowego choroby w sąsiedztwie markera wartość LOD score musi dla autosomów być większa od 3, a dla chromosomu X większa od 2. Oznacza to odpowiednio 1000- lub 100-krotnie większą szansę wspólnej segregacji alleli markera z cechą choroby, niż przypadkowe przekazanie cech ze sobą niesprzężonych.

Badanie rodzin techniką tworzenia map genomu opartych na sprzężeniach jest bardzo wrażliwe na heterogenność choroby i prowadzi do wyników fałszywie ujemnych. Jeśli heterogenność obserwuje się często, a stan chorobowy rozpoznaje na podstawie arbitralnej interpretacji wyników badań (np. nadreaktywność oskrzeli) - to metodą z wyboru jest badanie par rodzeństwa.

Rodzeństwo, wyłączając bliźnięta monozygotyczne, w 25% posiada identyczne obydwa allele, w 50% - jeden wspólny allel, a w 25% nie ma wspólnych alleli dla każdego z genów. Każde z pary rodzeństwa posiada połowę materiału genetycznego od matki i połowę od ojca. Jest dziełem przypadku, która połowa genomu rodzica zostanie przekazana dziecku. W wyniku zjawiska wymiany siostrzanych chromatyd nie zdarza się taki układ alleli różnych loci tego samego chromosomu, przy którym zachowane zostają identyczne komplety alleli (haplotypy) jak u rodziców. Dla krótszych segmentów DNA obserwuje się jednak zachowanie sprzężeń między sąsiednimi loci.

Badania par rodzeństwa oparte są na wielokrotnym testowaniu niezależności segregacji cech, czyli częstości wspólnego występowania alleli markera i cechy choroby. Jeśli dwoje rodzeństwa jest chore, przynajmniej jeden z alleli dla sprzężonego z chorobą markera powinien wystąpić u obojga z nich. Siłę sprzężenia zwiększa dodatkowo podobna obserwacja dotycząca markera zajmującego sąsiednie locus - w ten sposób można ustalić nawet kolejność miejsc genowych, tak jak na podstawie oceny frakcji rekombinacji.

Metoda badania par rodzeństwa wymaga dużej liczby badanych osób, łatwiej jednak zebrać tylko rodzeństwo niż rodzinę wielopokoleniową. Heterogenność choroby nie powoduje w badaniu par rodzeństwa zafałszowania wyników. W tej metodzie poszukuje się wspólnych haplotypów u obojga chorego rodzeństwa, a rekombinacje, które się obserwuje z powodu heterogenności, zmniejszają znamienność wyników, nie prowadząc jednak do fałszywego wykluczenia analizowanego regionu.

Większość stosowanych markerów genetycznych wybiera się ze względu na kompromis między łatwością oznaczenia genotypu a informatywnością układu. Bardzo prostym wskaźnikiem informatywności (polymorphism information content - PIC) jest prawdopodobieństwo jednoznacznego rozstrzygnięcia, czy odziedziczony allel markera genetycznego pochodzi od ojca, czy też od matki. Wskaźnik informatywności jest największy, gdy allele mają taką samą częstość (dla układu dwuallelicznego PIC = 0,375).

W szczególnych badaniach korzystających ze zdobyczy genetyki molekularnej używa się obecnie układów, w których PIC sięga 0,8. Są to wieloalleliczne układy VNTR, testowane w różnych populacjach ludzkich pod kątem pewności oznaczenia i zachowania stałej częstości allelicznej (równowagi genetycznej). Warunkiem równowagi genetycznej populacji, czyli częstości alleli niezmiennej w wielu generacjach, są: losowe kojarzenie par rodziców, brak wpływu alleli na zdolność prokreacji oraz minimalna częstość mutacji układu. Większość układów markerowych ma właśnie takie właściwości, i częstości ich genotypów pasują do reguły Hardy'ego i Weinberga. Reguła ta jest po prostu rozwinięciem dwumianu Newtona i wiąże ze sobą częstości alleli i częstości genotypów (tab. 2.).

Częstości alleli Genotyp AA (p2) Genotyp AB (2 pq) Genotyp BB (q2)
A = 0,5 (p)
B = 0,5 (q)
0,25 0,5 0,25
A = 0,9 (p)
B = 0,1 (q)
0,81 0,18 0,01

Częstości alleli Genotyp AA (p2) Genotyp AB (2pq) Genotyp AC (2pr) Genotyp BB (q2) Genotyp BC (2qr) Genotyp CC (r2)
A = 0,33 (p)
B = 0,33 (q)
C = 0,33 (r)
0,111 0,222 0,222 0,111 0,222 0,111
A = 0,7 (p)
B = 0,2 (q)
C = 0,1 (r)
0,49 0,28 0,14 0,04 0,04 0,01

Tab. 2. Zależność między częstościami alleli i częstościami genotypów w populacji pozostającej w równowadze genetycznej

Badania układów będących w równowadze genetycznej pozwalają wyliczyć prawdopodobieństwo, że pozwany jest ojcem dziecka w sprawie o dochodzenie spornego ojcostwa. Równie precyzyjnie można ustalić (lub wykluczyć), że pozostawiony ślad biologiczny (plama krwi, włosy, nasienie, komórki nabłonka) pochodzi od podejrzanego o dokonanie zbrodni.

W bardzo głośnej sprawie, w której oskarżono gwiazdę futbolu amerykańskiego i aktora O.J. Simpsona o morderstwo żony i jej przyjaciela, spory prawników dotyczyły właśnie interpretacji wyników badania układów polimorficznych w śladach biologicznych. Zwrócono w nich uwagę na ważny problem zróżnicowania rasowego i etnicznego człowieka, które powoduje, że praktyczna siła wykluczenia układów polimorficznych jest mniejsza od teoretycznej.

Teoretycznie kombinacja około 10 układów o dużej informatywności daje prawdopodobieństwo napotkania innej osoby o takim samym genotypie mniejsze niż 1 na 3 miliardy, w praktyce odchylenia częstości allelicznych spowodowane przynależnością do grupy etnicznej mogą zwiększyć to prawdopodobieństwo do 1 na 100 000. Zdumiewająco zaawansowane badanie układów polimorficznych prowadzone jest jednak do tej pory jedynie u koni pełnej krwi. W wielu krajach księgi stadninowe mają wpisy kilkunastu układów VNTR. A wydawało się, że koń jaki jest - każdy widzi.

O tym się mówi

  • 2,5 tys. rezydentur
    Resort zdrowia ogłosił wykaz rezydentur: 2,5 tys. młodych lekarzy rozpocznie jesienią naukę wybranej przez siebie specjalizacji za pieniądze z budżetu państwa.
  • Radźcie sobie sami
    Lekarze z małych szpitali nieraz całymi dniami wydzwaniają do specjalistycznych placówek z prośbą o przyjęcie ich pacjenta. Jeśli ryzyko śmierci jest duże albo leczenie drogie, odmawia im się ratunku pod byle pretekstem – alarmuje "Gazeta Wyborcza".
  • Pobierz wrześniową listę leków refundowanych
    1 września zaczyna obowiązywać nowy wykaz leków refundowanych. Po raz kolejny przygotowaliśmy dla Państwa listę leków refundowanych w formacie pdf (tylko 87 stron).
  • Leczy czy nie leczy?
    Zgodnie z Narodowym Programem Zwalczania Chorób Nowotworowych kobiety, u których wykryto mutacje genów BRCA1BRCA2 mogą na koszt państwa poddać się profilaktycznej mastektomii. Jednak za zabieg nikt nie chce płacić.
  • REKLAMA
    Winpocetyna nie tylko w zaburzeniach krążenia mózgowego.

    Dzięki wielokierunkowemu mechanizmowi działania winpocetyna ma wiele zastosowań terapeutycznych. Może być stosowana w schorzeniach neurologicznych (takich jak: zaburzenia krążenia mózgowego, zaburzenia poznawcze, otępienie naczyniopochodne i udary mózgowe) oraz otolaryngologii i okulistyce. Winpocetyna wyróżnia się bardzo dobrą tolerancją i korzystnym profilem bezpieczeństwa – wywołuje niewiele działań niepożądanych.
    Dowiedz się więcej.
    Partner portalu lekforte.pl Cavinton®Forte