Działania większości badaczy na świecie szły w kierunku uzyskania możliwie dużego stężenia antygenu w materiale roślinnym. My wykazaliśmy, że małe dawki działają tak samo dobrze, a nawet bardziej powtarzalnie niż duże.
Dr Józef Kapusta
Jerzy Dziekoński: Jak długo trwają prace nad wykorzystaniem roślin transgenicznych do produkcji szczepionek?
Dr Józef Kapusta: Pierwsza publikacja na ten temat ukazała się w prestiżowym dwutygodniku „Proceedings of the National Academy of Sciences” w grudniu 1992 roku. Przedstawiono w niej wyniki badań grupy amerykańskich uczonych dotyczących ekspresji antygenu powierzchniowego HBs wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w tytoniu. Od czasu tej publikacji ukazało się kilkanaście tysięcy artykułów naukowych dotyczących wytwarzania szczepionek z wykorzystaniem roślin. Trzeba jednak zaznaczyć, że badania na ten temat prowadzono już wcześniej, a zapoczątkowano je nie w Stanach Zjednoczonych, lecz w Polsce. Inicjatorem badań dotyczących wytwarzania antygenu HBs w roślinach był prof. Andrzej Płucienniczak, aktualnie emerytowany profesor w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków. Kilka miesięcy przed opublikowaniem pracy amerykańskich autorów, prof. Płucienniczak otrzymał grant Komitetu Badań Naukowych na prowadzenie badań nad produkcją antygenu HBs w roślinach. Było to 17 marca 1992 roku. Miałem przyjemność współpracować z prof. Płucienniczakiem, a nasza publikacja znajduje się wśród 10 najczęściej cytowanych oryginalnych prac dotyczących tego zagadnienia. Profesor Płucienniczak był prekursorem całego zamysłu – nie tylko ekspresji antygenów szczepionkowych w roślinach, ale także w transgenicznych zwierzętach.
Czy aktualnie stosowane szczepionki przeciwko WZW typu B nie są wystarczające? Dlaczego poszukuje się nowych rozwiązań z wykorzystaniem roślin?
Większość aktualnie stosowanych szczepionek
spełnia swoje zadanie, czyli chroni przed możliwym
zakażeniem. Wiadomo jednak, że niektóre osoby
nie wytwarzają odporności po szczepieniu, co może
wynikać m.in. z ich swoistej „konstelacji” genetycznej.
Ma to związek z układem antygenów zgodności
tkankowej HLA. To właśnie te obserwacje skłoniły
badaczy do przeprowadzenia prac w kierunku wykorzystania dodatkowych antygenów oprócz antygenu
HBs, będącego podstawowym komponentem
otoczki wirus (tzw. małego antygenu S-HBs, niekiedy
określanego jako HBsAg). Dodatkowe białka,
tj. pre-S2 i pre-S1, oprócz małego antygenu S-HBs,
są jako dodatkowe domeny wkomponowane do natywnej
otoczki wirusa. Tworzą one odpowiednio
średnie białko (M-HBs) – zawierające pre-S2 i małą
podjednostkę – oraz duże białko (L-HBs), które
zawiera odpowiednio w kolejności pre-S1, pre-S2 i małą podjednostkę. Chodzi o ekspresję dodatkowych
komponentów białkowych z natywnej otoczki
wirusa w celu zwiększenia efektywności odpowiedzi
immunologicznej. Szczepionki, które zawierają
więcej niż tylko to jedno białko w otoczce, dają lepszą
odpowiedź.
Pierwotny zamysł prof. Płucienniczaka polegał
na wykorzystaniu rośliny jako źródła szczepionki,
która byłaby wytwarzana podobnie jak klasyczna
szczepionka przeciwko WZW typu B. Jakiś
czas temu zrodził się jednak pomysł, aby rośliny
traktować jako źródło szczepionki podawanej
doustnie. Zaczęliśmy się wtedy zastanawiać nad
wykorzystaniem odpowiedniej do tego celu rośliny.
Zależało nam na tym, aby wybrać roślinę jadalną, w dodatku jadalną na surowo.
Jakie są ich zalety w porównaniu z innymi systemami ekspresji genów (np. drożdże, komórki ssaków)?
Komponent szczepionkowy wytwarzany z roślin jest biosymilarem. Oznacza to, że w roślinie powstaje identyczny komponent szczepionkowy jak w systemie ssaczym czy drożdżowym. Białko, którego ekspresję uzyskuje się w roślinie, podobnie jak w hepatocycie lub w komórce drożdży, samorzutnie przyjmuje strukturę, która z wyglądu przypomina białko wirusa. Zważywszy, że takie procesy zachodzą w roślinach, które można spożywać doustnie, możemy mówić o potencjalnym źródle dużo tańszej szczepionki. Biorąc pod uwagę sposób rozmnażania roślin, masę właściwego komponentu szczepionki i potencjalną łatwość jej wytwarzania, zyskujemy cały pakiet niewątpliwych zalet. W porównaniu z drożdżami czy komórkami ssaczymi, które wymagają trudniejszych do uzyskania warunków hodowli, koszt wytworzenia takiej prototypowej szczepionki jest o wiele mniejszy.
Czy są jakieś kryteria wyboru roślin?
Stwierdziliśmy, jak już powiedziałem, że musi
to być roślina, którą można zjeść w sposób naturalny
na surowo. Wielu wybitnych biotechnologów, w tym m.in. Amerykanie, podejmowało próby
wytworzenia w roślinach antygenów szczepionkowych,
uzyskując ekspresję antygenu HBs w transgenicznych
ziemniakach, a konkretnie w bulwie
ziemniaka. Bulw ziemniaka nie można jednak
jeść na surowo. Nieugotowane są kompletnie niesmaczne i niestrawne. Antygen szczepionkowy
wytwarzany w roślinie nie może być natomiast
poddawany obróbce termicznej (np. gotowaniu),
ponieważ w tych warunkach białko, jakim jest
antygen HBs, ulega denaturacji.
W naszej ocenie optymalnym wyborem jest sałata,
którą zawsze spożywa się na surowo. Uzyskaliśmy
całkiem przyzwoitą ekspresję antygenu
HBs w tej roślinie i najpierw przeprowadziliśmy
próby na zwierzętach, a później badanie kliniczne
na małej grupie osób. Do badania wybraliśmy osoby
niezaszczepione, które nie przebyły zakażenia
HBV. W pierwszym podejściu 3 z 5 zakwalifikowanych
osób dostały do spożycia transgeniczną
sałatę wytwarzającą antygen HBs, a 2 pozostałe – zwykłą sałatę. Wyniki tych badań opublikowaliśmy w 1999 roku na łamach znanego amerykańskiego
czasopisma „The FASEB Journal”.
Okazało się, że wszystkie 3 osoby po spożyciu
ostatniej porcji transgenicznej sałaty zaczęły wytwarzać
przeciwciała anty-HBs. Sałatę podawano
2-krotnie w porcjach po 300 gram w 2-miesięcznym
odstępie. 2 tygodnie po spożyciu ostatniej porcji
sałaty stężenie przeciwciał anty-HBs u 2 osób
osiągnęło poziom ochronny, czyli zabezpieczający
przed zakażeniem, a u 1 znajdowało się poniżej
tego poziomu, niemniej jednak odpowiedź była
wyraźna. Oczywiście u osób, które spożyły zwykłą
sałatę, nie obserwowano żadnej odpowiedzi
immunologicznej.
Czy później kontynuowano te badania?
Tak, przeprowadzono kolejne badania, w których
potwierdzono, że spożywanie sałaty z antygenem
HBs daje odpowiedź immunologiczną. Ta
odpowiedź jest niewielka – stężenie przeciwciał
czasami przekracza poziom ochronny, czyli 10 jednostek
(10 IU/l), a czasami mieści się poniżej tego
progu. Warto wspomnieć, że podając sałatę, nie
stosowaliśmy żadnych adiuwantów. Sałata zawierała
tylko utworzone z antygenu HBs wirusopodobne
cząstki obecne w komórkach.
Zrezygnowaliśmy jednak z pomysłu traktowania
roślin jako szczepionki pierwotnej, koncentrując
się na ocenie wykorzystania roślin
do stworzenia szczepionek przypominających
dla osób wcześniej zaszczepionych preparatem
podawanym w postaci wstrzyknięcia. Nasze założenia
najpierw potwierdziliśmy w badaniach
na zwierzętach. Myszy zaszczepiono klasyczną
szczepionką w dawce dostosowanej do małych
gryzoni, tj. 0,5 µg antygenu HBs, a następnie
podzielono je na trzy grupy – w grupie pierwszej
ponownie podawano szczepionkę we wstrzyknięciu w dawce 0,5 µg, w grupie drugiej podawano
dożołądkowo antygen HBs w materiale transgenicznej
sałaty w dawce 10-krotnie mniejszej,
tj. po 50 ng (0,05 µg), natomiast w grupie trzeciej
podawano dożołądkowo równoważną porcję tkanki
roślinnej nietransgenicznej. Po zakończeniu
doświadczenia okazało się, że myszy, które były
wcześniej zaszczepione i później dostawały mniejszą
dawkę, odpowiedziały statystycznie tak samo
jak myszy, które 2-krotnie otrzymały klasyczną
szczepionkę. U myszy, które najpierw otrzymały
szczepionkę w postaci wstrzyknięcia, a następnie
nietransgeniczny materiał roślinny, końcowe
stężenie przeciwciał anty-HBs było średnio kilka
razy mniejsze niż u zwierząt powtórnie zaszczepionych
„klasyczną” szczepionką lub dożołądkowo
antygenem zawartym w roślinie. Zauważyliśmy,
że dawka antygenu podawanego doustnie wcale
nie musi być duża. Działania większości badaczy
na świecie szły w kierunku uzyskania możliwie
dużego stężenia antygenu w materiale roślinnym.
My wykazaliśmy, że małe dawki działają tak samo
dobrze, a nawet bardziej powtarzalnie niż duże.
Czy takie badania przeprowadzono też u ludzi?
Tak, takie badania przeprowadzili Amerykanie,
którzy koncentrowali się na wytwarzaniu
antygenu HBs w ziemniakach. Do badania zakwalifikowali
oni trzy grupy pacjentów zrekrutowanych
spośród pracowników służby zdrowia, a jego wyniki opublikowali w 2005 roku na łamach
„Proceedings of the National Academy of Sciences”.
Co ciekawe, osoby, którzy stale pracują w ochronie
zdrowia, z nie do końca poznanych przyczyn
gorzej reagują na szczepienia. Do badań wybrano
osoby, które po szczepieniu wytworzyły przeciwciała
anty-HBs w stężeniach mieszczące się w przedziale 0–100 mIU/ml. Jedna grupa spożyła
3-krotnie surowe ziemniaki transgeniczne, druga 2 razy ziemniaki transgeniczne i 1 zwykłe, natomiast
trzecia tylko ziemniaki zwykłe. Odpowiedź
immunologiczna w dwóch grupach, które otrzymały
ziemniaki transgeniczne, była bardzo dobra.
Stężenie przeciwciał zwiększyło się od kilkunastu
do nawet kilkuset razy w porównaniu z wartościami
wyjściowymi. Należy jednak zaznaczyć, że nie
wszystkie osoby wytworzyły odpowiedź. W zależności
od grupy bardzo dobrą odpowiedź na szczepionkę
wytworzyło 60–80% badanych. W niektórych
przypadkach stężenie przeciwciał zwiększyło
się nawet do kilkunastu tysięcy jednostek.
Jak dotąd my nie przeprowadziliśmy takich badań
klinicznych. Powód jest prozaiczny – są one
bardzo drogie. Kiedy prowadziliśmy pierwsze badania,
Polska nie była jeszcze w Unii Europejskiej.
Od tego czasu bardzo się zmieniły przepisy dotyczące
badań klinicznych. Dzisiaj przeprowadzenie
badań drugiej i trzeciej fazy oznacza koszty, które
dla nas są zupełnie nieosiągalne.
Jaka ma być ostatecznie postać szczepionki, nad którą trwają prace?
Zawsze pojawia się pytanie, co się dzieje z prototypową
szczepionką podawaną doustnie. Nie raz
słyszałem już opinie, że przecież to wszystko zostanie
strawione. Tymczasem okazuje się, że podając doustnie antygen szczepionkowy w rozsądnej
dawce (ok. 20 µg), już po 4 godzinach można potwierdzić
jego obecność w krwioobiegu.
Nad postacią szczepionki pracowaliśmy intensywnie.
Rośliny różnią się zawartością i poziomem
czynnika szczepionkowego, który nas interesuje. W jednych roślinach jest go mało, a w innych
dużo. Zależało nam na ujednoliceniu poziomu
ekspresji w samych roślinach, na przykład przez
rozmnażanie wegetatywne roślin produkujących
dużo czynnika szczepionkowego, a następnie pozyskaniu
preparatu o jednolitym składzie. Przeprowadziliśmy
liofilizację materiału roślinnego.
Po rozdrobnieniu i wymieszaniu otrzymujemy
jednorodny materiał o określonej zawartości antygenu. W stosunkowo prosty sposób materiał ten
można zmielić i uzyskać proszek, który z kolei
można uformować w tabletkę o ścisłej zawartości
antygenu. Szczepionka może mieć zatem postać
produktu farmaceutycznego o określonych parametrach.
Co więcej, opracowaliśmy też metodę
jej przechowywania. Tabletki wytworzone w taki
sposób można przechowywać w temperaturze
pokojowej. Na świecie nie ma szczepionki, którą
od momentu wyprodukowania do czasu podania
pacjentowi można przechowywać w temperaturze
pokojowej. Wszystkie obecnie produkowane szczepionki
przechowuje się w temperaturze do około
4oC, co stanowi pewną niedogodność. Nasz preparat
można przechowywać w atmosferze azotu
przez rok, zachowując jego właściwości. Jest to
zatem szczepionka doustna i przechowywana w temperaturze pokojowej. Na nasze szczepionki
otrzymaliśmy 4 patenty, w tym 1 europejski, który
przyznano nam kilka miesięcy temu.
Czy zgłosiła się jakaś firma, która chciałaby skorzystać z patentu?
Widzi Pan, nikt się jeszcze nie zgłosił. Firmy,
które wytwarzają szczepionki w sposób klasyczny,
nieźle na tym zarabiają. Nasza szczepionka potencjalnie
mogłaby być tańsza. Niemniej jednak przed
jej wejściem na rynek należałoby przeprowadzić
wiele badań klinicznych, co wiąże się z dużymi
nakładami.
Naszym zdaniem preparat w takiej postaci
może stanowić ciekawą alternatywę jako szczepionka
przypominająca dla osób uprzednio zaszczepionych tradycyjnym preparatem podawanym
we wstrzyknięciu. Myślę, że szczepionka w formie tabletki przechowywanej w temperaturze
otoczenia byłaby bardzo atrakcyjna w krajach tropikalnych,
gdzie niełatwo jest utrzymać temperaturę
+4oC. Przyjęcie przypominającej szczepionki w formie tabletki doustnej nie wymagałoby też
zaangażowania personelu medycznego.
Czy jest koncepcja, jak dawkować takie szczepionki? Czy wystarczy pojedyncza dawka?
Jest to kwestia już obowiązującej praktyki, a w przypadku prototypowej szczepionki doustnej w postaci tabletki wymaga dalszych badań. Zgodnie z ogólnymi zaleceniami szczepionkę przeciwko WZW typu B podaje się w określonych schematach, które są różne w poszczególnych krajach. Przykładowo pełny, standardowy cykl szczepienia składa się z 3 dawek szczepionki podawanych w ciągu 6 lub 12 miesięcy, w zależności od kraju. Osoby z grupy zwiększonego ryzyka zakażenia powinny natomiast przyjmować dawkę przypominającą. Takie postępowanie należy także rozważyć, jeżeli poziom przeciwciał anty-HBs zmniejszy się do wartości <10 mIU/ml, a w niektórych krajach <100 mIU/ml. Generalnie wydaje się, że taką szczepionkę można stosować do końca życia co 5 lat – przynajmniej w pewnych grupach pacjentów. Wszystko oczywiście zależy od tego, jak dany organizm reagowałby na szczepienie.
Jakie wyniki uzyskano do tej pory (immunogenność, trwałość odpowiedzi immunologicznej)? Czy są jakiekolwiek dane dotyczące tolerancji lub występowania działań niepożądanych po zastosowaniu takich szczepionek?
Większość osób dotąd nieszczepionych na podanie
pierwszej dawki szczepionki roślinnej, czyli
na szczepienie pierwotne (tzw. priming) zwykle
odpowiada wytworzeniem przeciwciał anty-HBs. U niektórych pacjentów zaszczepionych w ten
sposób stężenie przeciwciał przekracza poziom
ochronny. Zależy to od schematu szczepień i zastosowanej
dawki. Nie znamy wszystkich czynników
związanych z odpowiedzią na podanie rośliny
produkującej szczepionkę w ramach szczepienia
pierwotnego, ponieważ ich poznanie nie jest naszym
celem. Zamiast dopracowywać warunki
samodzielnego stosowania szczepionki roślinnej,
skoncentrowaliśmy się nad użyciem jej jako
dawki przypominającej, kiedy poziom odpowiedzi
immunologicznej jest bardzo duży. U myszy,
które dostały tylko jedną dawkę antygenu HBs w postaci szczepionki klasycznej, a nie otrzymały
powtórnej dawki, poziom przeciwciał wynosi 10,
50, a nawet 100 IU. Po podaniu doustnym (dożołądkowym)
szczepionki przypominającej w postaci
rośliny, co warto podkreślić – bez dodatku
adiuwanta – stężenie to zwiększa się nawet kilkadziesiąt
razy. Amerykańskie badania kliniczne
pokazują, że analogicznie jest u ludzi. Reguła
jest taka – im mniejsze jest wyjściowe stężenie
przeciwciał anty-HBs, tym lepsza jest odpowiedź
na dawkę przypominającą. Obserwacje te potwierdzono u zwierząt, ale prawdopodobnie znajdą one
potwierdzenie także i u ludzi. U osób, u których
stężenie przeciwciał po szczepieniu zmniejszyło się
do 0, po podaniu dawki przypominającej akceleracja
odpowiedzi może być bardzo duża. Decyduje o tym kontekst immunologiczny i pewne osobnicze
interakcje zachodzące między antygenem a komponentami
układu immunologicznego, który dzięki
pierwotnemu zaszczepieniu jest gotowy na reakcję.
Mechanizm akceleracji i osobniczego zróżnicowanie
skali odpowiedzi nie jest do końca poznany.
Pytając o bezpieczeństwo tego typu szczepionek,
zahaczamy o kwestie dotyczące bezpieczeństwa
spożywania roślin transgenicznych. Nie należę
do huraoptymistów, którzy zajmowali się wytwarzaniem
roślin transgenicznych. Uważam, że niektóre
rośliny transgeniczne wytwarzane w celu
produkcji pożywienia dla ludzi mogą stanowić zagrożenie.
Jest to związane z tym, jaką cechę, jaką
właściwość, jaką nową jakość ma nieść roślina
transgeniczna. Twierdzenie, że wszystko wiemy o konsekwencjach spożycia rośliny transgenicznej
jest bardzo dużym nadużyciem. Do zagadnień
związanych z roślinami transgenicznymi należy
podchodzić bardzo ostrożnie, ponieważ nie sposób
przewidzieć odległych skutków ich stosowania.
Mówiąc o konkretnym przykładzie transgenicznej
sałaty jako nośnika szczepionki przeciwko
WZW typu B, trzeba zdawać sobie sprawę z tego,
że rośliny transgeniczne z antygenami HBV zawierają
także sekwencje DNA, które kodują wytwarzane w roślinie antygeny. Warto sobie zadać
pytanie, czy będzie to miało jakieś konsekwencje?
Wydaje się, że nie, ale czy tak jest na pewno? Odpowiedź
na to pytanie wymaga badań. Powiedziałem,
że nie jestem huraoptymistą, nie jestem jednak
też pesymistą. Trzeba do tych spraw podchodzić z otwartą głową. Na zakończenie chciałem podkreślić
jeszcze raz, to co już powiedziałem wcześniej.
Nasza prototypowa szczepionka doustna anty-HBV w formie tabletki, stabilna w temperaturze pokojowej,
odmienna niż wszystkie inne szczepionki, nie
zawiera żadnych adiuwantów ani konserwantów.
Jest to o tyle istotne, że w piśmiennictwie i nie
tylko toczy się dyskusja na temat potencjalnych
zagrożeń dla zdrowia pacjentów wynikających z zawartości w szczepionkach różnych dodatków,
poza właściwym czynnikiem szczepionkowym.
Rozmawiał Jerzy Dziekoński
Dr Józef Kapusta jest absolwentem biologii na Uniwersytecie Adama Mickiewicza w Poznaniu (1982), doktorat obronił w 1993 r. w Instytucie Genetyki Roślin PAN. Od 2004 r. jest pracownikiem naukowym w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie. Wcześniej był zatrudniony m.in. w Instytucie Dendrologii PAN, Instytucie Genetyki Roślin PAN, Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN. Pracował na kontraktach zagranicznych: 1993–1994 (visiting professor) w Purdue University, West Lafayette USA, 1997 (honor senior research assoc.) w University Of Western Australia, Perth, Australia, 2001–2002 (visiting professor) w Thomas Jefferson University, Filadelfia, USA. Kierownik projektów badawczych finansowanych z różnych źródeł, m.in. Komitetu Badań Naukowych, NCBiR, Fundacji Nauki Polskiej. Współautor kilkudziesięciu publikacji naukowych i kilku przyznanych zastrzeżeń patentowych z zakresu wakcynologii – krajowych i zagranicznych.