Diagnostyka laboratoryjna COVID-19

Co to jest COVID-19?

Choroba COVID-19 (ang. Coronavirus Disease 2019) jest chorobą zakaźną spowodowaną przez wirusa SARS-CoV-2 (ang. severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) i obecnie stanowi poważny problem zdrowotny na całym świecie. Wirusa po raz pierwszy zidentyfikowano w mieście Wuhan w Chinach i pochodzi on prawdopodobnie od wirusa zakażającego gatunek nietoperzy Rhinolophus affinis. Do zakażenia wirusem SARS-CoV-2 dochodzi drogą kropelkową, poprzez bliski kontakt lub wydzielinę dróg oddechowych osoby zakażonej. Objawy COVID-19 pojawiają się od 3 do 14 dni od zakażenia. Najczęstszymi objawami choroby są gorączka powyżej 38°C, kaszel, duszności i osłabienie. Inne, rzadsze objawy to bóle mięśni i głowy, krwioplucie, biegunka.

Przeczytaj: Koronawirus (COVID-19) - najnowsze informacje

Jakie są obecnie możliwości diagnostyczne COVID-19?

Rozpoznanie zakażenia koronawirusem (SARS-CoV-2) nie jest możliwe tylko na podstawie samych objawów klinicznych. Dlatego kluczową rolę w rozpoznaniu odgrywają badania laboratoryjne. W tym celu wykorzystuje się dwa rodzaje testów:

• testy molekularne (genetyczne)
• testy serologiczne (immunologicznie).

Obydwa badania różnią się zarówno zasadą działania, materiałem biologicznym potrzebnym do analizy, wartością kliniczną uzyskanych wyników, jak i ceną. Aktualnie jedyną rekomendowaną przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) i inne ważne instytucje metodą potwierdzającą rozpoznanie COVID-19 są testy molekularne oparte na metodzie reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR).

W jakim celu wykonuje się badania w kierunku wirusa SARS-CoV-2?

Zwykle badania diagnostyczne przeznaczone do rozpoznania choroby zakaźnej służą wdrożeniu odpowiedniego schematu leczenia. Niestety, w przypadku COVID-19 nie dysponujemy skutecznym leczeniem przyczynowym, dlatego głównym powodem szeroko wykonywanych badań w kierunku wirusa SARS-CoV-2 jest ocena rzeczywistego stanu rozmiarów epidemii. Pozwala to na szybkie „wyłapanie” osób, które stanowią źródło zakażenia w populacji oraz ich odizolowanie na czas choroby, żeby nie zarażały kolejnych osób.

Co to są testy molekularne, które stosuje się w diagnostyce COVID-19?

Badania molekularne oparte na metodzie PCR są jedyną metodą pozwalającą na stwierdzenie bezpośredniej obecności wirusa SARS-CoV-2 w badanym materiale biologicznym (tzw. bezpośrednie metody laboratoryjne). Ponadto badania molekularne są kluczowe w monitorowaniu przebiegu zakażenia i potwierdzeniu wyleczenia pacjenta z COVID-19. Badanie takie musi być wykonywane w specjalnie przeznaczonym do tego laboratorium, które spełnia przynajmniej stopień bezpieczeństwa biologicznego 2 (ang. Biosafety Level 2 – BSL2). Z tym, że izolacja samego wirusa SARS-CoV-2 musi się odbyć w laboratorium BSL3. Następnie, po izolacji, procedura wykrycia wirusa może już się odbyć w laboratorium o niższym stopniu bezpieczeństwa – BSL2.

Dokładną sekwencję materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 natychmiast udostępniono w publicznych bazach medycznych po wybuchu epidemii w Chinach 10 stycznia 2020 roku, co pozwoliło na bardzo szybkie opracowanie i zastosowanie metod molekularnych w diagnostyce wirusa. W przypadku diagnostyki COVID-19 stosuje się specyficzną odmianę metody PCR, czyli PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (w skrócie RT-PCR). Zastosowanie właśnie tej metody wynika z faktu wyjątkowości materiału genetycznego, jaki zawiera wirus SARS-CoV-2, czyli RNA (człowiek i większość organizmów jako nośnik informacji genetycznej wykorzystuje DNA).

Badanie RT-PCR w czasie rzeczywistym polega na wielokrotnym powielaniu określonego fragmentu materiału genetycznego, czyli RNA wirusa. Do badania wykorzystuje się specjalne do tego celu przeznaczone zestawy odczynników i sprzęt laboratoryjny, aby zapewnić jak najbardziej wiarygodne wyniki w trakcie samego badania, co wymaga szeregu kontroli laboratoryjnych. Metoda RT-PCR w czasie rzeczywistym dzięki powielaniu określonych fragmentów materiału genetycznego wirusa i wykorzystaniu specjalnych barwników fluorescencyjnych jest metodą ultraczułą, pozwalającą na wykrycie w badanym materiale biologicznym nawet niewielkiej liczby cząsteczek wirusowych.

Z jakiego materiału biologicznego wykonuje się badanie molekularne?

Tak samo kluczowe, jak poprawne przeprowadzenie badania RT-PCR przez diagnostę laboratoryjnego, jest prawidłowe pobranie materiału do badania molekularnego. U osób bez objawów pobiera się materiał z górnych dróg oddechowych, tj. wymaz z jamy nosowo-gardłowej lub gardła za pomocą specjalnych wymazówek. Jednak prawdopodobieństwo wykrycia materiału genetycznego wirusa w górnych drogach oddechowych zmniejsza się wraz z upływem czasu od zakażenia. Dlatego nie jest to najdoskonalszy materiał do analiz i w tym przypadku mogą pojawiać się wyniki fałszywie ujemne (czyli u osoby zakażonej koronawirusem [SARS-CoV-2] wynik będzie ujemny), szczególnie jeśli materiału nie pobrano prawidłowo.

Materiał z dolnych dróg oddechowych pobiera się od pacjentów z cięższymi objawami i jest to plwocina albo wydzielina pobrana z płuc podczas bronchoskopii – popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL) lub bronchoaspirat. Jest to najlepszy i najpewniejszy materiał do badań molekularnych, gdyż oznaczenie w nim daje mniejsze prawdopodobieństwo uzyskania wyniku fałszywie ujemnego.

Co to są metody serologiczne, które stosuje się w diagnostyce COVID-19?

W odróżnieniu od metod molekularnych, które badają bezpośrednią obecność wirusa SARS-CoV-2 w organizmie, metody serologiczne badają jego obecność pośrednio. W tym celu wykrywa się występowanie w materiale biologicznym białek odpornościowych (przeciwciał) wytworzonych w trakcie odpowiedzi odpornościowej przeciwko wirusowi SARS-CoV-2. Każde przeciwciało jest wytwarzane specyficznie przeciwko określonemu fragmentowi białka wirusowego (antygenowi).

Zobacz: Czy zakażenie koronawirusem (SARS-CoV-2) pozostawia trwałą odporność (chroni przed kolejnym zakażeniem)?

Na pierwszym etapie odpowiedzi odpornościowej na wirusa pojawiają się przeciwciała w klasie M (IgM), które z czasem są zastępowane bardziej trwałymi przeciwciałami w klasie G (IgG). Tę zależność wykorzystuje się w diagnostyce różnych chorób zakaźnych. W uproszczeniu, duże stężenie przeciwciał IgM i IgG zwykle oznacza aktywne zakażenie, natomiast duże stężenie IgG i małe IgM oznacza przebyte zakażenie w przeszłości.

Do najpowszechniej stosowanych metod serologicznych w laboratoriach należą metoda immunoenzymosorpcyjna ELISA oraz metody oparte na immunoblottingu. Badania serologiczne wykorzystują właściwości do tworzenia przez antygen (czyli np. wirus) i przeciwciało połączeń, które można porównać do dopasowania klucza do odpowiedniego zamka. Modyfikując laboratoryjnie przeciwciała, np. poprzez przyłączanie do nich barwników fluorescencyjnych lub enzymów, można wykrywać określone cząsteczki w materiale biologicznym, np. specyficzne przeciwciało przeciwko wirusowi SARS-CoV-2.

W przypadku tzw. szybkich testów kasetkowych, których nie wykonuje się w laboratorium, wykorzystuje się metodę immunochromatografczną. Testy te przypominają w zasadzie działania testy ciążowe dostępne w aptekach. Wynik uzyskuje się w ciągu kilkunastu minut.

Największym ograniczeniem badań serologicznych jest zjawisko tzw. okna serologicznego, czyli okresu od chwili zakażenia wirusem do momentu wytworzenia przez pacjenta specyficznych przeciwciał. Okres ten jest różny dla różnych wirusów. W trakcie trwania okna serologicznego wyniki badań serologicznych mogą dawać wyniki ujemne, nawet jeśli pacjent jest zakażony wirusem SARS-CoV-2, są to tzw. wyniki fałszywie ujemne. Podobnie sytuacja wygląda u osób z niedoborami odporności, np. po chemioterapii, które mogą nie wytwarzać odpowiedniej ilości przeciwciał.

Ze względu na to, że SARS-CoV-2 jest nowym patogenem, nie wiadomo także w jakim dokładnie czasie zachodzi wytwarzanie przeciwciał przeciwko wirusowi (tzw. serokonwersja). Wstępne badania sugerują, że serokonwersja w przypadku wirusa SARS-CoV-2 to czas około 2 tygodni od zakażenia. Oznacza to, że w tym czasie organizm jeszcze nie zdążył wytworzyć specyficznych IgM i IgG przeciwko wirusowi.

Wartość diagnostyczna badań serologicznych jest ograniczona w przypadku zakażenia wirusem SARS-CoV-2, dlatego aktualnie Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) nie rekomenduje tych badań do rozpoznania COVID-19 oraz przy podejmowaniu decyzji klinicznych, dopóki nie będą dostępne dowody potwierdzające ich zastosowanie. Pamiętajmy, że pozytywny wynik badania serologicznego musi i tak być potwierdzony badaniem molekularnym, ponieważ przeciwciała są również obecne u ozdrowieńców, czyli osób które przechorowały daną chorobę.

Warto jednak podkreślić, że testy serologiczne będą niezwykle przydatne w badaniach epidemiologicznych po wygaszeniu lub ustaniu pandemii. Z uwagi na to WHO i Amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) zaczęły opracowywać oficjalne testy serologiczne wykrywające przeciwciała IgM i IgG przeciwko SARS-CoV-2, które będą służyły właśnie do tego celu.

Z jakiego materiału biologicznego wykonuje się badanie serologiczne?

Badania serologiczne wykonuje się z krwi: osocza lub surowicy. Niektóre szybkie testy kasetkowe wykorzystują również materiał pobrany z dróg oddechowych pacjenta.

Diagnostyka COVID-19 w Polsce – krok po kroku

1. Osoba z podejrzeniem COVID-19:
   a. jeśli występują u niej objawy jak gorączka, kaszel, duszność,
   b. podróżowała w rejony, w których podejrzewa się utrzymującą się transmisję wirusa SARS-CoV-2,przy czym to kryterium nie jest już stosowane, ponieważ Polska jest krajem, w którym wirus rozprzestrzenia się lokalnie,
   c. miała bliski kontakt z osobą, u której stwierdzono zakażenie SARS-CoV-2,
   d. pracowała lub odwiedzała placówkę medyczną, w której leczono zakażonych SARS-CoV-2,
   powinna jak najszybciej skontaktować się telefonicznie z najbliższą stacją sanitarno-epidemiologiczną, w której po wstępnym wywiadzie zostanie poinstruowana, gdzie i jak zostanie pobrany materiał do badania molekularnego.
2. Materiał biologiczny pobiera się tylko od osoby podejrzanej o zakażenie wskazanej przez stację sanitarno-epidemiologiczną albo tych, którzy znaleźli się na oddziałach tzw. szpitali jednoimiennych. Tylko lekarz może zlecić badanie molekularne w kierunku SARS-CoV-2 i nie ma możliwości wykonania badania indywidualnie za opłatą.
3. Materiał do badania molekularnego pobiera z górnych dróg oddechowych osoba uprawniona: lekarz, pielęgniarka, diagnosta laboratoryjny lub ratownik medyczny.
4. Pobranie materiału polega na wymazie z:
   a) nosogardzieli, w tym przypadku osoba pobierająca po wyjęciu wymazówki z plastikowej probówki wprowadza ją głęboko przez otwór nosowy pacjenta i obraca kilkukrotnie przez kilka sekund, procedurę wykonuje się w obydwu otworach nosowych
   b) lub gardła i błon śluzowych nosa pobranych jednocześnie, w tym przypadku osoba pobierająca po wyjęciu wymazówki z plastikowej probówki wprowadza ją głęboko do gardła, za języczek podniebienny pacjenta, aż dotknie tylnej ściany gardła, wtedy wymazówkę obraca się kilkukrotnie i pociera o powierzchnię błony śluzowej gardła, następnie wymazówkę wprowadza się do obydwu nozdrzy.
5. Po pobraniu wymazówkę z powrotem umieszcza się w plastikowej probówce. Niestety procedura może być nieprzyjemna dla pacjenta. Odpowiednio zabezpieczoną i opisaną próbkę pacjenta rejestruje się w systemie zarządzania kryzysowego, a następnie przesyła do wyznaczonego laboratorium przez Ministerstwo Zdrowia, które m.in. stosuje odczynniki rekomendowane przez WHO.
6. Próbkę pacjenta odbiera laboratorium, gdzie wykonuje się badanie molekularne za pomocą metody RT-PCR.
7. Laboratorium podaje pierwsze wyniki w ciągu 24–48 godzin, jeśli wynik jest negatywny, a nadal istnieje uzasadnione podejrzenie, że pacjent jest chory na COVID-19, pobiera się kolejną próbkę i powtarza badanie.

dr n. med. Karolina Karabin

Biolog molekularny, diagnosta laboratoryjny, konsultant ds. żywienia i stylu życia.
Z wykształcenia biolog ze specjalizacją mikrobiologia i diagnosta laboratoryjny z ponad 10-letnim stażem w pracy laboratoryjnej. Absolwentka Studium Medycyny Molekularnej oraz członek Polskiego Towarzystwa Genetyki Człowieka. Kierownik grantów naukowych realizowanych w Pracowni Diagnostyki Molekularnej przy Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych WUM. Tytuł doktora nauk medycznych w zakresie biologii medycznej obroniła na I Wydziale Lekarskim WUM. W pracy naukowej interesują ją mechanizmy molekularne powstawania różnych chorób, ponieważ jest to klucz do zapobiegania im i punkt wyjścia do opracowywania skutecznych terapii. Z tego powodu w swojej pracy doktorskiej zajmowała się zagadnieniem podłoża genetycznego białaczek u dorosłych i możliwością zastosowania u nich terapii celowanych.
Autorka wielu prac naukowych i popularnonaukowych z zakresu diagnostyki laboratoryjnej, biologii molekularnej i żywienia. Jej pasją jest dietetyka i tematy związane ze zdrowiem przewodu pokarmowego. Szczególnie interesuje ją wpływ szeroko pojętego współczesnego stylu życia na procesy molekularne w organizmie. Dlatego na co dzień jako specjalista w zakresie diagnostyki laboratoryjnej prowadzi dział merytoryczny w Cambridge Diagnostics Polska oraz współpracuje z zespołem dietetyków w Poradni Dietetycznej CD. Oprócz tego na konferencjach, szkoleniach, webinarach oraz na łamach czasopism branżowych i portali internetowych dzieli się ze specjalistami i pacjentami praktyczną wiedzą dotyczącą diagnostyki i dietoterapii chorób.