Przyszłość szczepionek to nanocząsteczki

Jerzy Dziekoński

Przyszłość szczepionek to nanocząsteczki (…) zrobione z emulsji, liposomów, polimerów czy metali. Są bezpieczne, mają odpowiednią powierzchnię, na której można prezentować antygeny, łączą cechy adiuwantu i systemu transportowego – mówi dr Mariusz Skwarczyński.


Fot. dr n. med. Mariusz Skwarczyński

Jerzy Dziekoński: Jest Pan chemikiem, studiował Pan we Wrocławiu. Jak to się stało, że trafił Pan do Australii na Uniwersytet w Queensland?

dr n. med. Mariusz Skwarczyński: W Polsce, we Wrocławiu, obroniłem doktorat i tam też przez chwilę pracowałem. W kraju trudno było wówczas zrobić karierę naukową, dlatego starałem się wyjechać za granicę, chciałem zobaczyć, jak nauka wygląda na świecie. Na początku, dzięki kontaktom recenzenta mojej pracy doktorskiej, wyjechałem na staż podoktorski do japońskiej Tokushimy, a następnie do Kyoto, gdzie spotkałem profesora Istvana Totha z Australii, który był z pochodzenia Węgrem. Nić polsko-węgierska związała nas od razu – zatrudnił mnie w swoim laboratorium na University of Queensland i tak ostatecznie trafiłem do Australii.

Zakres tematów, jakimi się zajmowałem od początku swojej kariery naukowej, z czasem ewoluował – zaczęło się od biotransformacji, później zainteresowałem się ciężką syntezą organiczną związków przeciwnowotworowych, a następnie pojechałem na drugi staż do Japonii, gdzie zająłem się modyfikacją związków przeciwnowotworowych do proleków. Natomiast od początku mojego pobytu w Australii pracowałem i nadal pracuję nad szczepionkami. Większość laboratoriów, w których prowadziłem badania naukowe w swojej karierze, zajmowało się peptydami. Pierwszy grant, który dostałem w Australii, dotyczył przeciwnowotworowych szczepionek peptydowych. Można powiedzieć, że połączyłem w jedno całe moje dotychczasowe doświadczenie zdobywane w innych laboratoriach – badania nad rakiem, peptydami i szczepionkami – i wykorzystuję je w obecnym miejscu pracy.

Skąd wzięło się Pańskie zainteresowanie systemami nośnikowymi i adiuwantami w szczepionkach?

Z moich badań nad szczepionkami peptydowymi. Bez adiuwantów, szczególnie właśnie w przypadku preparatów peptydowych, niewiele da się zrobić. Temat zafascynował mnie do tego stopnia, że w statystykach za lata 2012–2022 byłem trzecim naukowcem na świecie pod względem liczby publikacji dotyczących szczepionek peptydowych.

Jakie są zatem cechy idealnego adiuwantu w szczepionkach dla ludzi?

W rzeczywistości nie ma idealnego adiuwantu, ale trzeba zdawać sobie sprawę z właściwości, jakie powinien posiadać. Przede wszystkim powinien być nietoksyczny. Szczepionki zwykle podaje się ludziom zdrowym, więc jak najmniejsza toksyczność jest bardzo ważną cechą. Jedną z zasad działania adiuwantu jest dostarczenie układowi immunologicznemu sygnału o niebezpieczeństwie. Naśladując w jakiś sposób drobnoustrój chorobotwórczy, szczepionka zawierająca adiuwant informuje organizm o niebezpieczeństwie. W naturalny sposób odporność wzbudza czynnik, który jest rozpoznawany w organizmie jako zagrożenie, na przykład toksyny bakteryjne. Adiuwant musi takie czynniki naśladować. Kłopot w tym, że pierwsze adiuwanty stosowane in vitro były bardzo toksyczne. Naszym zadaniem jest taka modyfikacja cząsteczki, aby z niebezpiecznego związku zrobić bezpieczny. Dobrym przykładem jest monofosforylolipid A, czyli MPLA. Oryginalny lipid A wyizolowany z bakterii to bardzo silny i skuteczny adiuwant. Był jednak bardzo toksyczny, więc żeby móc go stosować w szczepionkach przeznaczonych dla ludzi, trzeba było odciąć jedną grupę fosforylową, co automatycznie zmniejszyło jego toksyczność. Nie oznacza to, że zupełnie pozbawiono go toksyczności w przypadku zbyt dużej dawki, ale jesteśmy pewni, że w dawkach stosowanych w szczepionkach jest zupełnie bezpieczny.

Najważniejsze – adiuwant musi wywoływać szybką i trwałą odpowiedź immunologiczną. Adiuwant, który nie stymuluje układu immunologicznego, nie uczy go szybkiej reakcji, będzie całkowicie nieprzydatny. Nie może jednak stymulować nadmiernej reakcji zapalnej, gdyż wówczas zwiększa się reaktogenność takiej szczepionki, a także ryzyko poważniejszych niepożądanych odczynów poszczepiennych. Reakcja zapalna powinna być odpowiednia do oczekiwanej odpowiedzi immunologicznej (immunogenności), jednak przy jak najlepszej tolerancji i dobrym profilu bezpieczeństwa (bez ciężkich odczynów niepożądanych).

Adiuwant powinien także chronić antygen przed degradacją. I tutaj wchodzimy w rozważania na temat różnic między adiuwantem a systemem nośnikowym antygenu szczepionkowego, jednak warto dodać, że obie te funkcje praktycznie się nakładają. Zadaniem adiuwantów jest wzbudzenie silniejszej odpowiedzi immunologicznej, natomiast systemu nośnikowego – dostarczenie antygenu w całości i w odpowiednie miejsce. Nakładanie się tych funkcji oznacza, że system nośnikowy działa też jak adiuwant, ponieważ wzmacnia odpowiedź immunologiczną, a jednocześnie chroni antygen, żeby nie uległ degradacji po drodze. Jest to szczególnie ważne w przypadku szczepionek „nieżywych” podawanych drogą doustną, gdyż antygeny (a szczególnie peptydy) mogą się stać elementem pożywienia, a nie czynnikiem naśladującym zakażenie i stymulującym swoistą ochronną odpowiedź immunologiczną.

Bardzo istotne jest, aby adiuwant był tani w masowej produkcji. Szczepionki nie są towarem dla ludzi bogatych, tylko dla wszystkich. Z reguły, jako obywatele, chcemy otrzymywać wszystkie szczepionki za darmo, więc muszą być one kosztowo efektywne dla systemów ochrony zdrowia, czyli możliwie jak najtańsze. Ponadto adiuwant musi być kompatybilny z antygenem. Jeżeli na przykład antygen jest naładowany pozytywnie, a adiuwant negatywnie, to bez problemu łączą się i razem podróżują w naszym organizmie.

Adiuwant powinien być też stabilny w jak najszerszym zakresie temperatur i w różnych warunkach: w trakcie przechowywania, transportu czy wstrzykiwania szczepionki. W Afryce temperatura pokojowa może wynosić nawet 35°C. Z praktycznego punktu widzenia bardzo istotna jest również możliwość opatentowania adiuwantu. Jeśli firma nie będzie mogła opatentować szczepionki, nie będzie zainteresowana jej rozwojem w sensie komercyjnym.

Idealny adiuwant powinien być aktywny niezależnie od metody dostarczania do organizmu. Jednak w praktyce zwykle dana substancja dobrze działa dostarczona tylko jedną, konkretną drogą, na przykład domięśniowo. Wydaje się, że jest to naturalne, bo mamy do czynienia z różnym środowiskiem, z różnymi ludzkimi tkankami.

Adiuwant powinien być aktywny już w małym stężeniu i „oszczędzać” dawkę antygenu potrzebną do uzyskania oczekiwanej odpowiedzi. Wiąże się to też z minimalną toksycznością.

Skuteczny adiuwant musi ograniczać liczbę dawek przypominających, gdyż częste powtarzanie szczepienia może doprowadzić do zwiększonej tolerancji i niekorzystnie wpływać na immunogenność oraz skuteczność szczepionki. Trzeba na to uważać, zwłaszcza w przypadku szczepionek „nieżywych” podawanych doustnie. Chodzi więc o to, aby adiuwant był wystarczająco mocny, ale nie był toksyczny i działał szybko, najlepiej po podaniu 1 lub 2 dawek szczepionki.

Nie ma idealnych związków, które miałyby wszystkie opisane cechy, ale można wyróżnić pewne grupy, które spełniają większość z tych warunków. Adiuwantami najczęściej są ligandy receptorów na powierzchni komórek prezentujących antygeny (m.in. dendrytycznych), najczęściej receptorów toll-podobnych (TLR). Mogą nimi być również nanocząsteczki. Zwykle, ze względu na swój rozmiar, przypominają wirusa lub małe bakterie. Dzięki temu nasz układ immunologiczny rozpoznaje je jako zagrożenie.

Jakie są korzyści z łączenia kilku substancji o właściwościach adiuwantowych w jednej szczepionce? Takie rozwiązanie zastosowano m.in. w powszechnie stosowanych szczepionkach przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka (HPV), na przykład w szczepionce Cervarix (MPLA i glin)?

De facto zastosowano tam 3 adiuwanty. Szczepionka zawiera cząsteczki wirusopodobne (virus-like particle – VLP), czyli zbudowana jest w taki sposób, aby przypominała wirusa. I już sam ten zabieg działa jako adiuwant. Dodatkowo w składzie jest jeszcze glin, który jest słabym, ale bezpiecznym adiuwantem, oraz wspomniany wcześniej MPLA. Połączenie tych 3 elementów daje synergiczny efekt. MPLA jest rozpoznany przez TLR-4. Glin częściowo uszkadza ludzkie komórki w okolicy jego depozycji, które wydzielają swoją zawartość i to ona jest rozpoznawana przez komórki immunologiczne jako sygnał inwazji. Natomiast VLP udają cząsteczki wirusa, co również wywołuje alarm. Łącząc te 3 elementy, uzyskuje się szybszą odpowiedź immunologiczną, która jest zapamiętana na dłużej. Trzeba to jednak robić umiejętnie i ostrożnie. Nie można wrzucić wszystkich trików do jednej szczepionki i oczekiwać, że uzyskamy super adiuwant, gdyż zwiększa się w ten sposób ryzyko toksyczności do nieakceptowalnego poziomu. Poza tym istnieje ryzyko niekorzystnej interakcji – jeden adiuwant może zakłócić strukturę lub działanie drugiego, na przykład nieodpowiedni adiuwant może przesłonić VLP, a cząsteczki niewidoczne dla układu immunologicznego nie spełnią swojej roli. Łączenie ze sobą różnych adiuwantów jest jak łączenie leków – istnieje ryzyko, że działania niepożądane i interakcje znacznie przewyższą oczekiwane korzyści.

Czy adiuwanty aktualnie stosowane w szczepionkach dla ludzi, nie tylko te stare, ale również te nowoczesne, są niewystarczające? Dlaczego ciągle poszukuje się nowych?

Prawie przez 100 lat dostępny był tylko jeden adiuwant używany do wszystkich szczepionek – sole glinu. Jest to adiuwant względnie słaby, nadający się głównie do preparatów, w których stosuje się całe, zabite drobnoustroje (np. dostępne w Polsce szczepionki przeciwko WZW typu A lub całokomórkowa szczepionka przeciwko krztuścowi). Do wielu szczepionek podjednostkowych, zawierających jako antygen fragment patogenu (np. wybrane białko), jest zwykle zbyt słaby. W przypadku peptydów lub niektórych białek sole glinu nie spełniały swojej roli, więc trzeba było wynaleźć nowe adiuwanty, na przykład MF59 (użyty w szczepionce Fluad przeciwko grypie sezonowej, niedostępnej w Polsce, ale stosowanej np. w USA lub niektórych krajach Unii Europejskiej – przyp. red.), czyli emulsja oleju w wodzie zawierająca skwalen lub różne inne emulsje.

Wszystkie aktualnie zarejestrowane na świecie adiuwanty, oprócz CpG 1018 – cytozynofosfoguaniny (CpG) będącej syntetycznym fragmentem DNA naśladującym wirusowy lub bakteryjny materiał genetyczny (zastosowano go np. w szczepionce Heplisav B przeciwko WZW typu B [niedostępnej w Polsce, ale zarejestrowanej w UE – przyp. red.]), bazują na liposomach albo emulsjach, czyli różnych cząsteczkach lipidowych. Agencje rejestrujące leki dopuszczają do użytku komercyjnego każdy z tych nowych adiuwantów tylko w 1 lub 2 szczepionkach. Nie są one, tak jak glin, używane uniwersalnie w kilkudziesięciu różnych preparatach, ale są integralnym składnikiem konkretnego preparatu handlowego (1 lub góra 2). Nie wiadomo więc, czy są kompatybilne z innymi szczepionkami. Za każdym razem ich zastosowanie w nowej szczepionce wymaga powtórzenia całego procesu badań, w tym badań klinicznych wszystkich faz przedrejestracyjnych. To poważne utrudnienie i widać wyraźnie, że brakuje bardziej uniwersalnego nowego adiuwantu.

Różne szczepionki działają w różnych kierunkach. Jeśli chcemy przygotować szczepionkę profilaktyczną, naszym celem jest wzbudzenie układu odpornościowego do produkcji przede wszystkim swoistych przeciwciał, które stanowią główną linię ochrony przed zakażeniem. Natomiast w przypadku szczepionek leczniczych (np. przeciwnowotworowych) oczekujemy aktywacji głównie swoistych limfocytów cytotoksycznych, czyli ramienia komórkowej odpowiedzi immunologicznej. To wymaga zupełnie różnych dróg aktywacji układu immunologicznego, dlatego potrzebujemy do tego odmiennych adiuwantów.

Czym w takim razie różni się adiuwant od systemu nośnikowego szczepionki?

Weźmy na przykład liposomy. Można w nich zamykać nanocząsteczki z antygenem. Dzięki temu zabezpieczony antygen może podróżować układem limfatycznym do węzłów chłonnych. Dotrze tam w nienaruszonej postaci i dzięki temu wywoła silniejszą odpowiedź immunologiczną. A jeśli jakaś struktura lub substancja wywołuje silniejszą odpowiedź immunologiczną, to z definicji jest adiuwantem, więc te właściwości się nakładają. Ciągle jednak można powiedzieć, że niektóre związki lub struktury pełnią tylko rolę nośnika. Jeśli weźmiemy liposom neutralny, to poza transportem i ochroną antygenu przed degradacją w organizmie nie będzie miał on żadnego innego zadania. Kiedy jednak zastosujemy liposomy naładowane dodatnio, szczególnie z niektórymi składnikami, to obok funkcji ochronnej będą one pełnić również rolę adiuwantu, bo będą rozpoznawane przez komórki prezentujące antygeny (APC). Ich rola będzie więc podwójna.

Skoro funkcję nośnika i adiuwantu można połączyć w jednym związku lub strukturze, to czy taką charakterystykę mają na przykład nanocząsteczki lipidowe, które są nośnikiem w aktualnie zarejestrowanych szczepionkach mRNA przeciwko COVID-19?

Tak, nanocząsteczki lipidowe to liposomy, które rzeczywiście są takim nośnikiem łączącym obie funkcje. Można zmodyfikować ich powierzchnię, żeby na przykład dostarczyć odpowiednie, dołączane do nich ligandy. Dzięki temu łatwiej są rozpoznawane przez komórki układu immunologicznego. W szczepionkach mRNA zastosowano właśnie taki zabieg, jednak w tym przypadku sytuacja jest bardziej skomplikowana, bo nie dostarczamy gotowego antygenu do komórek, a tylko przepis, matrycę do jego produkcji w komórkach mięśniowych. Mamy zatem na starcie pewne opóźnienie tych dwóch procesów, więc nie można powiedzieć, że zachodzi tutaj prosty mechanizm wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Najpierw następuje bowiem reakcja na adiuwant (nanocząsteczkę lipidową), a dopiero później na wyprodukowany antygen. Ale jak wykazały liczne badania kliniczne, w praktyce to dość dobrze działa.

Które z aktualnie badanych nowych związków rokują najlepiej jako adiuwanty w szczepionkach?

Potencjalnie przydatnych związków jest naprawdę dużo, tak jak dużo jest drobnoustrojów chorobotwórczych. Nasz organizm przez miliony lat ewolucji nauczył się samoobrony, dlatego potrafi rozpoznać niebezpieczne cząsteczki i w odpowiedzi na zagrożenie może uruchomić system skutecznej obronny. Naukowcy nauczyli się takie cząsteczki podrabiać w różny sposób. Można w tym celu używać polimerów, szczególnie tych biodegradowalnych, które często są używane także jako systemy do dostarczania antygenów, albo peptydów, które agregują. W mojej opinii właśnie peptydy są bardzo obiecujące, gdyż są bezpieczne i zupełnie naturalne, jako że składają się – tak jak ludzkie białka – z aminokwasów. Ale muszą one agregować, tworzyć nanostruktury. Potencjał mają również cukry, na przykład wspomniany wcześniej MPLA jest związkiem cukrowym. Są też cukry produkowane z chininy, które sprawdzają się jako adiuwant w szczepionkach podawanych doustnie. Mają one charakterystyczną właściwość – przyklejają się do błony śluzowej jelita cienkiego. Pod uwagę bierze się również nieorganiczne nanocząsteczki – na przykład glin w tej postaci sprawdza się dużo lepiej niż glin w postaci roztworu żelowego, który stosowano w szczepionkach początkowo. Glin można oczywiście zastąpić innym metalem lub pierwiastkiem, na przykład złotem lub wapniem. W przypadku metali (np. złota) istnieje jednak ryzyko akumulacji w organizmie, dlatego lepszym rozwiązaniem wydaje się zastosowanie wapnia.

Na pewno będą się rozwijały wszelkie emulsje. Większość adiuwantów stosowanych w obecnie dostępnych szczepionkach bazuje właśnie na nich. Zawsze można je poprawić, dodać inne składniki rozpoznawane przez TLR. Adiuwantem mogą być również mniej nieoczywiste substancje, takie jak kwasy żółciowe, których próbowaliśmy używać w naszym laboratorium. Okazało się, że działają. W grze są oczywiście VLP, które aktualnie wykorzystuje się już w zarejestrowanych szczepionkach przeciwko HPV (Cervarix, Gardasil).

Generalnie, nigdy nie natrafiłem na publikację porównującą szeroką gamę adiuwantów. Nikt nie porównał na przykład 20 różnych rozwiązań, aby stwierdzić, które sprawdzają się najlepiej. Zwykle porównuje się opracowany przez określonego producenta adiuwant z jakimś innym uważanym za standard. Dostaliśmy ostatnio grant, żeby porównać różne adiuwanty naszej własnej produkcji i wybrać ten, który będzie najlepszy do zastosowania w szczepionce przeciwko paciorkowcom β-hemolizującym grupy A (group A Streptococcus – GAS). Dla obecnych i przyszłych badaczy pole do popisu jest bardzo szerokie.

Jeśli chodzi o poszukiwanie nowych adiuwantów, to wiele zależy od drogi podawania szczepionki i systemu nośnikowego. Przed chwilą wyjaśniłem, z czego to wynika, na przykładzie szczepionek podawanych we wstrzyknięciach lub doustnie. Wstrzyknięcie domięśniowe lub podskórne automatycznie lokalizuje materiał szczepionkowy w tkankach, natomiast szczepionka podana doustnie może przebyć całą drogę przez układ pokarmowy i jest ryzyko, że zostanie wydalona lub na którymś etapie strawiona. Liposomy zupełnie nie nadają się do preparatów podawanych doustnie, gdyż zostaną zniszczone przez sole kwasów żółciowych, a w efekcie cały podawany w szczepionce materiał zostanie zdegradowany. Z drugiej strony jest pochodna chityny – chitozan, szczególnie w postaci metylowanej, cząsteczka obdarzona stałym ładunkiem dodatnim. Przywiera on do błony śluzowej przewodu pokarmowego i bardzo dobrze działa jako adiuwant w szczepionkach doustny, ale jego „przylepność” nie jest zupełnie potrzebna w szczepionkach podawanych we wstrzyknięciu.

Wspomniał Pan o szczepionce przeciwko GAS. Trwają intensywne badania przedkliniczne i kliniczne nad jej opracowaniem. Czy, podobnie jak preparaty mRNA przeciwko COVID-19, te szczepionki konstrukcyjnie różnią się od tradycyjnych szczepionek, które zawierają całe inaktywowane drobnoustroje lub wybrane całe białka?

Obecnie co roku na całym świecie z powodu chorób wywołanych przez GAS umiera około 300 000 osób. Problem śmiertelności dotyka głównie kraje rozwijające się lub mniejszości etniczne, na przykład państwa afrykańskie lub Aborygenów w Australii, bo w krajach o wysokich dochodach są dostępne bez ograniczeń antybiotyki, co z kolei wpływa na ich nadużywanie i generowanie lekooporności drobnoustrojów. Po raz pierwszy próbę zastosowania szczepionki przeciwko GAS podjęto w 1923 roku i po ponad 100 latach od tego pierwszego eksperymentu nadal nie udało się uzyskać satysfakcjonujących wyników i żaden preparat nie jest stosowany w praktyce. W tych wczesnych próbach używano eksperymentalnych szczepionek zawierających całe zabite bakterie, a więc preparatów opartych na tradycyjnej technologii. Odpowiedź immunologiczna, mówiąc najoględniej, nie była najmocniejsza. Największym problemem były jednak ciężkie zdarzenia niepożądane w postaci choroby autoimmunizacyjnej serca. Zlokalizowane na powierzchni GAS białka były bowiem podobne do miozyny mięśnia serca ludzi, a w efekcie szczepienia odpowiedź immunologiczna przeciwko bakterii stawała się niebezpieczna dla pacjenta.

Z tego powodu prace nad taką szczepionką zawieszono. Próbowano podejść do tematu inaczej. Z bakterii wyizolowano tylko białko M, które jest jednym z kilku czynników zjadliwości GAS i posiada właściwości antyfagocytarne. Okazało się jednak, że z białkiem M był ten sam problem, bo – jak już teraz wiadomo – to właśnie m.in. ono było odpowiedzialne za porażkę pierwszej szczepionki, gdyż pewne epitopy są podobne do białek ludzkiego serca. Z powodu tej kontrowersji w USA na jakiś czas w ogóle zakazano pracy nad tą szczepionką. Później wymyślono, że zamiast całego białka można zastosować jeszcze mniejsze fragmenty – sekwencje peptydowe niespotykane w ludzkich tkankach. Ta koncepcja 30–40 lat temu ponownie otworzyła drogę do dalszych badań, ale pojawił się nowy problem: najbardziej immunogenna część białka M to wystający ponad błonę komórkową końcowy fragment, a do tej pory zdefiniowano 250 jego serotypów. Zatem, aby przygotować szczepionkę działającą na wszystkie możliwe serotypy GAS, należałoby opracować 250 preparatów lub szczepionkę multipoliwalentną, co jest ekonomicznie niemożliwe. Postawiono więc na szczepionki zawierające 25–30 serotypów dominujących w USA. W Afryce, gdzie jest największy problem ze śmiertelnością i chorobowością, nie będą one skuteczne. Nie będą to więc szczepionki uniwersalne.

Później pojawił się pomysł, aby poszukać uniwersalnego antygenu, wspólnego dla wielu szczepów GAS. Nadzieję wzbudził antygen J8, nad którym pracujemy w naszym laboratorium, jednak okazało się, że połowa szczepów GAS go nie posiada. Trwają więc dalsze poszukiwania uniwersalnego antygenu, ale problem okazał się większym wyzwaniem niż się wydawało. Około 2 lata temu opublikowano wyniki badania na małpach, w którym oceniono immunogenność 6 różnych białek GAS wyselekcjonowanych jako bardziej uniwersalne antygeny, ale tylko białko M indukowało zadowalającą odpowiedź immunologiczną.

Obecnie różne firmy farmaceutyczne testują inne antygeny, ale żadne badanie nie osiągnęło jeszcze fazy klinicznej. Do tego etapu przeszły jedynie preparaty peptydowe, ale jest to dopiero faza I lub II. Szczepionki peptydowe działają, owszem, ale nie tak dobrze, jak byśmy oczekiwali. Nawet jeśli taki preparat zostanie w końcu zarejestrowany do stosowania u ludzi, to nie będzie on przeznaczony dla wszystkich na całym świecie. Zatem na badacze mają jeszcze dużo pracy, aby opracować bezpieczną i skuteczną szczepionkę wobec wszystkich szczepów GAS. Nasz zespół jest jednym z tych, które biorą udział w tym wyścigu.

Jakie są inne problemy utrudniające uzyskanie skutecznych i bezpiecznych szczepionek peptydowych?

Największa grupa szczepionek peptydowych to szczepionki przeciwnowotworowe. I to nie profilaktyczne, a stosowane w immunoterapii. Badania nad nimi są najbardziej zaawansowane, wiele z nich jest już w III, przedrejestracyjnej fazie badań klinicznych. Generalnie problemy są podobne jak w przypadku szczepionek przeciwko GAS. W nowotworach mamy zmutowane białka, ale są to białka ludzkie, czyli istnieje ryzyko, że generując odpowiedź immunologiczną przeciwko nim, możemy wywołać chorobę autoimmunizacyjną jako działanie niepożądane. Główną barierą jest więc wybór odpowiedniego antygenu lub epitopu charakterystycznego tylko dla komórek nowotworowych, a wolnego od ryzyka reakcji krzyżowej z natywnymi białkami ludzkich tkanek. Kluczem do sukcesu są także odpowiednie adiuwanty, bo peptydy charakteryzują się małą immunogennością. Wiele z nich jest praktycznie niewidocznych dla układu immunologicznego – nie przypominają wirusa, bakterii ani żadnej toksyny. Adiuwanty w szczepionkach peptydowych muszą być szczególnie silne, ale nietoksyczne – i tu właśnie zaczyna się cała zabawa. Nie chcemy przecież, aby szczepionkę trzeba było podawać co najmniej 4 razy zanim zadziała, co aktualnie często jest potrzebne, aby wzbudzić odpowiedź immunologiczną.

Chyba największym problemem jest jednak znalezienie wystarczająco uniwersalnego peptydu, tzn. charakteryzującego się jak najmniejszą zmiennością w toku ewolucji (tzw. konserwatywnego). Wybór antygenu lub epitopu o dużej i szybkiej zmienności sprawi, że zanim taka szczepionka zostanie opracowana, przebadana zgodnie z obowiązującą procedurą kliniczną i zarejestrowana do użytku, będzie już nieskuteczna, gdyż zmieni się charakterystyka antygenowa jej celu.

Szczepionki peptydowe też nie będą skuteczne bez odpowiedniego nośnika. Czy można w nich wykorzystać adiuwanty aktualnie stosowane w innych szczepionkach?

Teoretycznie można to zrobić, ale prawie na pewno nie otrzymamy optymalnej odpowiedzi immunologicznej. Jakiś czas temu zmodyfikowaliśmy szczepionkę opartą na adiuwancie MF59 zawierającym skwalen. To jeden z najsilniejszych adiuwantów, ale zmieniliśmy go jeszcze pod kątem peptydów. Przygotowanie adiuwantu dla antygenów w postaci całych cząstek białkowych jest nieco łatwiejsze, bo taki antygen jest z natury bardziej immunogenny. Jeśli jednak chcemy zoptymalizować szczepionkę peptydową, to zamiast bazować na kilku już zarejestrowanych adiuwantach, musimy poszukać nowych związków.

Wiele nadziei wiąże się z technologią nanocząsteczek w szczepionkach. Jakie zalety i wady ma ta technologia?

Mówiąc o zaletach nanocząsteczek, w pierwszej kolejności trzeba wskazać na ich łatwe rozpoznawanie przez komórki prezentujące antygeny, ponieważ mają rozmiar wirusa. Endocytoza lub fagocytoza zachodzi łatwiej, gdyż nanocząsteczka jest dla komórek układu immunologicznego tworem, który należy sprawdzić. W tym przypadku duże znaczenie ma wielkość nanocząsteczki, ponieważ dzięki niej można wybrać drogę, którą zostanie pobrana do komórek: poprzez fagocytozę lub endocytozę do endosomów. Jeśli chcemy uzyskać odpowiedź limfocytów CD8, antygen musi trafić do cytoplazmy, podobnie jak dostarcza się mRNA. Jeśli mRNA zostanie w endosomach, szczepionka nie zadziała.

Poza tym, jeśli wybierzemy dostatecznie duże cząsteczki, wielkości mikrometra, i wstrzykniemy je domięśniowo lub podskórnie, to one pozostaną w miejscu depozycji i – jeśli to odpowiednio zaprogramujemy – będą wolno uwalniać antygen. Reakcja będzie podobna do reakcji po zadrapaniu i miejscowym zakażeniu takiej rany. Natomiast bardzo małe nanocząsteczki mogą swobodnie podróżować w naszym układzie limfatycznym i same docierać do węzłów chłonnych, czyli dokładnie tam, gdzie znajdują się skupiska limfocytów. I nie muszą ich tam dostarczać komórki dendrytyczne lub inne makrofagi. Skoro mogą same podróżować, szybciej wywołują odpowiedź immunologiczną i jest ona silniejsza. Zwykle rozmiar 20–50 nanometrów uznaje się za optymalny dla takich nanocząsteczek. Dodatkowo, jeśli są one naładowane dodatnio, są łatwiej pobierane przez makrofagi i limfocyty, co również stymuluje silniejszą odpowiedź immunologiczną.

Mogą być dostarczane do cytoplazmy, przez co dochodzi do prezentacji krzyżowej. Szczególne znaczenie ma to w szczepionkach przeciwnowotworowych lub takich, których efektem ma być m.in. eliminacja zakażonych komórek, czyli na przykład szczepionek przeciwwirusowych. Nanocząsteczka najczęściej jest tak zbudowana, że antygen prezentowany jest na jej powierzchni. Mamy taką piłeczkę z włoskami na powierzchni, a te włoski to właśnie antygen. Wirus wygląda identycznie. To podobieństwo sprawia, że zawarty w szczepionce materiał jest o wiele łatwiej rozpoznawany przez układ immunologiczny. Dodatkowo gęste upakowanie antygenu na powierzchni sprawia, że nie jest on szybko niszczony przez enzymy. Można też zamykać cały antygen w środku nanocząsteczki.

Nanocząsteczkami można więc łatwo manipulować – nie tylko zmieniać ich wielkość lub ładunek, ale także hydrofobowość, a nawet kształt, bo to również ma znaczenie. Opublikowaliśmy niedawno pracę o zastosowaniu nanocząsteczek w różnych kształtach i różnych sposobach dostarczania antygenu w różne miejsca organizmu. Okazało się, że różne kształty w odmiennych lokalizacjach różnie działają. Szczególnie ciekawe jest to, że pałeczki często działają lepiej niż nanocząsteczki kuliste (globularne). Można to regulować, więc nanocząsteczkami łatwiej wywołać oczekiwaną odpowiedź immunologiczną. Oczywiście takie dopracowanie nanocząsteczek to lata badań, ale jest to możliwe.

Czy użycie peptydów jako nanocząsteczek ma jakieś dodatkowe zalety?

Tak, są one biodegradowalne do zwykłych naturalnych aminokwasów. Trudno o bezpieczniejszy składnik. Nawet niektóre lipidy nie są dla organizmu człowieka naturalne, a w przypadku nanocząsteczek peptydowych otrzymujemy naturalne ludzkie aminokwasy. Nasze enzymy tną nanocząsteczki peptydowe dosyć wolno, ale właśnie o to chodzi. Gdyby zbyt szybko zostały zdegradowane, odpowiedź układu immunologicznego byłaby niezadowalająca. I jeszcze rzecz najciekawsza: nanocząsteczki peptydowe mogą indukować odpowiednią konformację peptydu antygenowego, który jest fragmentem większego białka – jeśli w natywnym białku miał on na przykład strukturę helikalną, to później, podawany jako peptyd antygenowy, musi tę helikalność zachować, żeby indukować produkcję skutecznych, swoistych przeciwciał. W innym przypadku wyprodukowane przeciwciała będą bezużyteczne, bo nie rozpoznają oryginalnego patogenu i go nie wyeliminują.

Niestety są też problemy. Nanocząsteczki nie zawsze są wystarczająco „agresywne”. Czasami potrzebna jest więcej niż jedna dawka takiej szczepionki, aby wzbudzić odpowiedź immunologiczną. Z reguły do uzyskania szybkiej odpowiedzi konieczne są pewne modyfikacje. Dotyczy to szczególnie nanocząsteczek peptydowych, które potrzebują wiązania chemicznego z antygenem, co z natury stanowi problem syntetyczny. Trzeba dobrać odpowiedni ciąg aminokwasu do odpowiedniego antygenu i w ten sposób utworzyć cząsteczki. Nie da się stworzyć jednego uniwersalnego peptydowego ciągu aminokwasu do wszystkich możliwych szczepionek – trzeba to robić dla każdego rodzaju szczepionki oddzielnie.

Produkcja peptydów na masową skalę również może sprawiać pewne problemy, ale robi się to już w przypadku leków, więc raczej sobie z tym poradzimy. No i koszty. Jeśli jednak byliśmy w stanie wyprodukować szczepionki mRNA na masową skalę, to raczej uniesiemy też koszt produkcji szczepionek peptydowych. Oczywiście wymaga to pewnego wysiłku, żeby zoptymalizować proces produkcji i koszty, ale jestem przekonany, że ostatecznie cena byłaby mniejsza niż w przypadku szczepionki mRNA przeciwko COVID-19.

Wspomniał Pan wcześniej o samoagregujących cząsteczkach peptydowych. Na czym polega ich konstrukcja i czy ten proces można kontrolować, aby uzyskać zawsze ten sam, pożądany efekt w szczepionkach, bez ryzyka zmiany właściwości epitopów?

Samoagregujące cząsteczki peptydowe muszą mieć właściwości amfifilowe, czyli być częściowo hydrofobowe, a częściowo hydrofilowe. Hydrofobowa część jest odpowiedzialna za agregowanie i tworzenie nanocząsteczki, a hydrofilowa, żeby takie cząsteczki były małe, pozostawały w zawiesinie i nie opadały na dno pojemnika, czyli żeby nie doszło do wytrącenia się związku. Tworzy się strukturę kulki albo pałeczki, w której zostaje zamknięta hydrofobowa część nośnika szczepionki. Część hydrofilowa zostaje na zewnątrz, dzięki czemu cząsteczka jest rozpuszczalna w wodzie. Proces ten można kontrolować, na przykład manipulując liczbą hydrofobowych jednostek, które dodajemy na etapie syntezy. Im jest ich więcej, tym łatwiej razem agregują. Im mniej, tym łatwiej będą się rozpuszczać. Na tym etapie trzeba uważać, żeby nie rozpuścić nanocząsteczki, albo żeby one zbyt mocno nie agregowały, dlatego liczbę jednostek hydrofobowych trzeba dobrać optymalnie. Jeśli się to już zrobi, to reszta działa w bardzo prosty sposób: wystarczy dodać cząsteczki do wody i wymieszać. Jest to proces powtarzalny, w wyniku którego zawsze powstaje ten sam rodzaj nanocząsteczek. Oczywiście przy produkcji takich szczepionek na linii produkcyjnej trzeba na wszelki wypadek sprawdzić, czy w danej partii wszystko przebiegło prawidłowo. Są na to, jak w przypadku każdego peptydu, proste sposoby kontroli jakości.

Jakie zalety ma wykorzystanie polimerów złożonych z hydrofobowych aminokwasów jako nośnika antygenów?

Zacznijmy od historii. Na początku próbowaliśmy używać poliakrylanu, czyli polimeru klasycznego, który nie jest biodegradowalny. Działało to bardzo dobrze: polimer tworzył cząsteczki i indukował silną odpowiedź immunologiczną. Był stabilny na tyle, że szczepionkę można było podawać nawet doustnie. Ale były też problemy. Klasyczne polimery mają nieokreśloną stereochemię, są mieszaniną cząstek o różnych konfiguracjach stereochemicznych, gdyż w każdej jednostce/monomerze mamy inną konfigurację. Liczba powtórzeń monomeru w polimerze jest nieokreślona. Jesteśmy w stanie tworzyć zawężoną liczbę jednostek, ale jest to precyzja liczona co najwyżej w tysiącach wersji polimeru zamiast w milionach. Powtarzalność takiej struktury jest więc ograniczona, ten proces można sterować tylko w ograniczonym zakresie. Dodatkowo mieliśmy inne problemy – po połączeniu antygenu z polimerem wszystko wyglądało doskonale, ale po zliofilizowaniu okazało się, że substancji nie można ponownie rozpuścić. Związek agregował na tyle mocno, że po usunięciu wody nic się już nie dało z nim zrobić. Wpadliśmy więc na pomysł, żeby użyć hydrofobowego aminokwasu. Struktura była bardzo podobna. Zamiast niedegradowalnego polimeru zastosowaliśmy polimer w pełni biodegradowalny, cięty na aminokwasy. Używamy powtórzenia tego samego aminokwasu, żeby naśladować tę funkcję polimeru, który składa się z powtórzeń identycznych jednostek (monomerów). Aminokwas hydrofobowy działał dokładnie tak samo jak poliakrylan, tyle że stereochemia była znana, bo to naturalny ludzki aminokwas L, liczba powtórzeń również, bo był syntetyzowany jak peptydy, i po liofilizacji oraz ponownym dodaniu wody produkował takie same nanocząsteczki. W ten sposób udało się wyeliminować agresywną agregację obserwowaną w przypadku poliakrylanu. Wszystkie te działania spowodowały, że odkryliśmy dobry system. Jest już opatentowany i interesuje się nim przemysł.

Czy nanocząsteczki peptydowe w szczepionkach wymagają jeszcze dodatkowego adiuwantu?

Nie. I to jest ich największa zaleta, że same działają w ten sposób.

Czy w szczepionkach peptydowych nie można byłoby wykorzystać nanocząsteczek lipidowych (liposomów) jako nośnika, podobnie jak w szczepionkach mRNA przeciwko COVID-19?

Tak, można byłoby, tylko nie zawsze to działa. Sprawdzaliśmy takie rozwiązanie w badaniach nad szczepionką przeciwko GAS. Dodanie liposomów nic nie zmieniło – nie zaszkodziło, ale też nic nie poprawiło. Skonstruowaliśmy także szczepionkę przeciwnowotworową, w której z kolei liposomy wniosły bardzo dużo dobrego. Dzięki nim byliśmy w stanie lepiej kontrolować rozmiar cząsteczek. Jeśli popatrzymy na białka, które są zakotwiczone w błonie komórkowej, bardzo często zawierają one leucynę. Zastosowaliśmy ją, aby na tej samej zasadzie antygeny dołączyć do liposomów, które przypominają właśnie błonę komórkową. Zostały zakotwiczone w liposomach za pomocą takich hydrofobowych aminokwasów.

Natomiast jeśli chodzi ogólnie o zastosowanie lipidowych nośników w szczepionkach peptydowych, to jest to powszechna procedura. Jest na to wiele przykładów, niestety żadnego z takich preparatów jeszcze nie zarejestrowano do stosowania w praktyce.

Jakie inne dobrze rokujące systemy nośnikowe są aktualnie w trakcie badań pod kątem ich wykorzystania w szczepionkach?

Wymienię jeszcze kilka dodatkowych systemów, o których nie wspomniałem wcześniej. Używa się modyfikowanych liposomów, na przykład wirosomów, które są liposomem z dołączonymi dodatkowymi wirusowymi białkami. Przypominają cząsteczkę wirusa, ale bez materiału genetycznego wewnątrz – tylko sama powłoka lipidowa z wbudowanymi antygenami białkowymi. To rozwiązanie już zastosowano i wykorzystano komercyjnie w jednej ze szczepionek przeciwko WZW typu A. Jest więc duża szansa, że będą powstawały inne preparaty o podobnej konstrukcji.

Innym przykładem jest kompleks immunostymulujący o akronimie ISCOM (immune-stimulating complex). Ma rozmiar około 40 nanometrów, a w jego składzie znajdują się m.in. cholesterol, fosfolipidy i saponiny. Przypomina liposom, tyle że mniejszy. Jest to tzw. nanoklatka (nanocage), w której można zamykać różne antygeny. Jest to równocześnie jeden z lepiej działających adiuwantów. ISCOM jest już używany na przykład w jednej ze szczepionek weterynaryjnych zarejestrowanych dla koni. Nie zastosowano go jeszcze w szczepionkach dla ludzi, ale wszystko przed nami.

Inne systemy to Pam2CysPam3Cys. Są to agoniści TLR2. Opublikowano już sporo różnych badań na temat tych związków i wiele wskazuje, że mogą się sprawdzić w szczepionkach.

Kolejny przykład to nanocząsteczki polimerowe, takie jak kwas polimlekowo-glikolowy (PLGA), będący kopolimerem kwasu mlekowego z kwasem glikolowym. Jest to biodegradowalny polimer estrowy, którego zastosowanie, także w produkcji leków, udokumentowano już w licznych badaniach. Jest bezpieczny, tworzy nanocząsetczki polimerowe, w których można zamknąć antygen. Istnieje zatem duża szansa, że jakaś grupa badawcza albo firma zdecyduje się użyć ten związek do produkcji szczepionek.

Czy technologia nanocząsteczek peptydowych stanowi przyszłość nowych szczepionek, czy może jednak należy ona do technologii mRNA i nanocząsteczek lipidowych, dzięki której mamy aktualnie skuteczne szczepionki przeciwko COVID-19?

Na razie mamy szczepionki mRNA tylko przeciwko COVID-19. Nie ma na razie żadnej innej zarejestrowanej szczepionki opartej na tej technologii. Technologia ta działa bardzo dobrze, naśladując naturalne zakażenie wirusowe, dlatego sądzę, że ma zagwarantowaną przyszłość w szczepionkach przeciwwirusowych. Natomiast czy będzie równie skuteczna w przypadku chorób bakteryjnych? Na tę odpowiedź będziemy musieli jeszcze poczekać. Nie sądzę jednak, aby preparaty mRNA całkowicie wyeliminowały inne rodzaje szczepionek. W tej technologii produkowane jest tylko białko, a to nie zawsze wystarczy do wzbudzenia skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Nadal w wielu przypadkach do produkcji szczepionek używa się całych drobnoustrojów, a nie można ich wytworzyć za pomocą technologii mRNA. Uważam, że zarówno szczepionki peptydowe, jak i mRNA mają zastosowanie w pewnych obszarach, ale nadal będą istniały szczepionki oparte na bardziej tradycyjnej technologii, tzn. podjednostkowe (białkowe) lub zawierające całe, inaktywowane patogeny.

Czy szczepionki peptydowe bada się tylko pod kątem wykorzystania w profilaktyce chorób infekcyjnych i leczeniu nowotworów?

Nie tylko. Nasz zespół opracował na przykład antykoncepcyjne szczepionki peptydowe przeznaczone do kontroli populacji zwierząt dzikich i domowych. W dużym uproszczeniu działają one w ten sposób, że blokują hormon odpowiedzialny za prokreację. Nie wyobrażam sobie, w jaki sposób miałaby to zrobić szczepionka mRNA. Hormon jest peptydem. Już na samym starcie mamy antygen, który jest peptydem. I to jest nasz cel. Nic więcej. Tam nie ma cząsteczki białkowej, nie ma nic prócz krótkiego peptydu. Opracowaliśmy więc szczepionkę przeciwko temu peptydowi.

Jak już wcześniej wspomniałem, technologia peptydowa sprawdza się również w leczniczych szczepionkach przeciwnowotworowych, które stanowią niemal połowę szczepionek peptydowych, nad którymi pracują aktualnie naukowcy na całym świecie. Przy ich projektowaniu trzeba bardzo uważać, żeby nie używać całych białek, aby nie zwiększyć ryzyka reakcji autoimmunizacyjnej. Dostępne są specjalne programy, które pozwalają wyszukać peptydy charakterystyczne tylko dla danego rodzaju nowotworu, nawet w wersji spersonalizowanej, czyli charakterystycznej tylko dla określonego pacjenta. Kiedy zostaną zidentyfikowane, podaje się je razem z adiuwantem, żeby niszczyć komórki rakowe. Właśnie w nowotworach ta technologia stwarza duże pole do popisu, podobnie jak w przypadku profilaktyki tych chorób infekcyjnych, kiedy niebezpieczne jest podanie całych drobnoustrojów (np. GAS).

W naszym laboratorium opracowaliśmy także szczepionkę przeciwko tęgoryjcowi dwunastnicy – pasożytowi, który jest szczególnie groźny w regionach, w których uprawia się ryż. Zarażenie tym pasożytem jest dużym problemem, a dochodzi do niego przez skórę. Wyzwanie dla szczepionki było duże, gdyż tęgoryjec bytuje w świetle jelita cienkiego, gdzie penetracja komórek układu immunologicznego jest bardzo ograniczona. Tęgoryjec żywi się jednak krwią człowieka, a wraz z nią zasysa przeciwciała, których produkcję można wywołać za pomocą szczepionki. Skupiliśmy się na enzymach trawiennych tęgoryjca, a w zasadzie na jednym z nich. Przyłączenie przeciwciał do enzymu blokuje jego aktywność, a tęgoryjec umiera z głodu. Kiedy podczas badań używaliśmy do immunizacji całego białka, w większości przypadków swoista odpowiedź immunologiczna była skierowana przeciwko innemu epitopowi niż oczekiwaliśmy, a enzym zachowywał swoją aktywność. Okazało się, że aby wywołać silną odpowiedź immunologiczną przeciwko właściwemu fragmentowi enzymu, trzeba było użyć peptydu, który tworzy ten konkretny epitop. Wyizolowaliśmy go, wstawiliśmy w nasz nośnik i w ten sposób wywołaliśmy odpowiedź immunologiczną, która hamowała aktywność enzymu trawiennego i zabijała pasożyta przez zagłodzenie. Kontynuujemy te badania, aby przygotować formalną szczepionkę.

Jakie są aktualnie najbardziej obiecujące kierunki badań nad adiuwantami i systemami nośnikowymi szczepionek?

Przyszłość szczepionek to nanocząsteczki. Nie ma znaczenia, czy są zrobione z emulsji, liposomów, polimerów czy metali. Są bezpieczne i mają odpowiednią powierzchnię, na której można prezentować antygeny. W tej chwili prowadzi się wiele badań w tym kierunku.

Jeśli popatrzymy na stosowane już szczepionki przeciwko COVID-19, to zauważymy, że wszystkie zawierają nanocząsteczki. Podobnie wektory wirusowe – to także nanocząsteczki. Podjednostkowa (białkowa) szczepionka przeciwko COVID-19 zawiera adiuwant Matrix-M, który ma postać nanocząsteczek. Inaktywowany wirus to również nanocząsteczka. Podobnie szczepionki DNA. Wcześniej wymieniłem wiele powodów, dlaczego tak się dzieje.

Dziękuję za rozmowę.

Dr Mariusz Skwarczyński obronił doktorat z chemii w 1999 r. na Politechnice Wrocławskiej. Staż podoktorski rozpoczął na Uniwersytecie Tokushima Bunri w Japonii pod kierunkiem nieżyjącego już prof. M. Nishizawy, gdzie zajmował się biomimetyczną syntezą całkowitą paklitakselu, leku przeciwnowotworowego. Następnie dołączył do laboratorium prof. Yoshiaki Kiso na Uniwersytecie Farmaceutycznym w Kioto (Japonia), gdzie prowadził badania nad prolekami. W 2004 r. otrzymał stypendium japońskie (staż podoktorski Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki) oraz grant badawczy na prowadzenie dalszych badań nad paklitakselem. Opracował nowe klasy proleków paklitakselu: izotaksoidy i fototaksele. Współtworzył także pozbawioną epimeryzacji metodę syntezy nowych elementów składowych (izodipeptydów) do syntezy peptydów na fazie stałej, a jednostki te zostały skomercjalizowane przez firmę Merck-Novabiochem. W 2008 r. dołączył do grupy prof. Istvana Totha na Uniwersytecie w Queensland (Australia). Od tego czasu jego badania skupiają się głównie na metodach dostarczania szczepionek peptydowych opartych na nanotechnologii. W 2010 r. otrzymał stypendium badawcze funduszu strategicznego University of Queensland. W Australii bierze udział w licznych wspólnych projektach badawczych konsorcjów krajowych i międzynarodowych w celu opracowania szczepionek przeciwko paciorkowcom β-hemolizującym grupy A (GAS), HIV, tęgoryjcowi dwunastnicy, zarodźcom malarii i nowotworom, a także antybiotyków przeciwko bakteriom wielolekoopornym.

23.05.2024
Zobacz także
Doradca Medyczny
  • Czy mój problem wymaga pilnej interwencji lekarskiej?
  • Czy i kiedy powinienem zgłosić się do lekarza?
  • Dokąd mam się udać?
+48

w dni powszednie od 8.00 do 18.00
Cena konsultacji 29 zł

Zaprenumeruj newsletter

Na podany adres wysłaliśmy wiadomość z linkiem aktywacyjnym.

Dziękujemy.

Ten adres email jest juz zapisany w naszej bazie, prosimy podać inny adres email.

Na ten adres email wysłaliśmy już wiadomość z linkiem aktywacyjnym, dziękujemy.

Wystąpił błąd, przepraszamy. Prosimy wypełnić formularz ponownie. W razie problemów prosimy o kontakt.

Jeżeli chcesz otrzymywać lokalne informacje zdrowotne podaj kod pocztowy

Nie, dziękuję.
Poradnik świadomego pacjenta