Nieprawidłowy wynik testu enzymatycznego (wskazujący na niedobór kwaśnej alfa-glukozydazy) wymaga niezależnego potwierdzenia za pomocą badania genetycznego. Badanie to można wykonać z wykorzystaniem materiału genetycznego (DNA) wyizolowanego z suchej kropli krwi. Badanie genetyczne powinno wykazać warianty patogenne w obu allelach genu GAA (kodującego kwaśną alfa-glukozydazę). U dzieci z postacią o wczesnym początku w obu allelach znajdują się mutacje powodujące całkowitą lub niemal całkowitą inaktywację genu. W przypadkach o późnym początku w co najmniej jednym allelu występuje wariant o słabszym efekcie patogennym. U 36–90% chorych na chorobę Pompego o późnym początku wykrywa się wariant c.-32-13T>G w intronie 1. Wariant ten nie zmienia sekwencji aminokwasowej enzymu, ale zmniejsza jego ekspresję (tzn. powstają prawidłowe cząsteczki enzymu, ale w niedostatecznej liczbie).
Podstawową metodą diagnostyki genetycznej jest analiza sekwencji wszystkich eksonów kodujących genu GAA wraz z przylegającymi fragmentami intronów w kierunku tzw. mutacji punktowych (dotyczących pojedynczych nukleotydów), które stanowią 83–93% wszystkich wariantów patogennych tego genu. Badanie to nie wykrywa rozległych delecji ani duplikacji genu GAA, stanowiących 5–13% wariantów patogennych. Wykrycie dużej delecji/duplikacji wymaga zastosowania innej techniki diagnostycznej (np. MLPA).
Najnowsza metoda badań genetycznych, tzw. sekwencjonowanie nowej generacji (next generation sequencing – NGS), pozwala przeanalizować równocześnie dużą liczbę genów (np. wszystkie geny o znanym związku z chorobami mięśni), a nawet cały eksom (eksony wszystkich genów) lub genom (niemal cały materiał genetyczny pacjenta). Wyniki badania NGS są zwykle złożone, a właściwa ocena potencjalnej patogenności wykrytych wariantów może być trudna.
