O pracach nad uzyskaniem doustnej szczepionki przeciwko WZW typu B

Działania większości badaczy na świecie szły w kierunku uzyskania możliwie dużego stężenia antygenu w materiale roślinnym. My wykazaliśmy, że małe dawki działają tak samo dobrze, a nawet bardziej powtarzalnie niż duże.

Dr Józef Kapusta

Jerzy Dziekoński: Jak długo trwają prace nad wykorzystaniem roślin transgenicznych do produkcji szczepionek?

Dr Józef Kapusta: Pierwsza publikacja na ten temat ukazała się w prestiżowym dwutygodniku „Proceedings of the National Academy of Sciences” w grudniu 1992 roku. Przedstawiono w niej wyniki badań grupy amerykańskich uczonych dotyczących ekspresji antygenu powierzchniowego HBs wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) w tytoniu. Od czasu tej publikacji ukazało się kilkanaście tysięcy artykułów naukowych dotyczących wytwarzania szczepionek z wykorzystaniem roślin. Trzeba jednak zaznaczyć, że badania na ten temat prowadzono już wcześniej, a zapoczątkowano je nie w Stanach Zjednoczonych, lecz w Polsce. Inicjatorem badań dotyczących wytwarzania antygenu HBs w roślinach był prof. Andrzej Płucienniczak, aktualnie emerytowany profesor w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków. Kilka miesięcy przed opublikowaniem pracy amerykańskich autorów, prof. Płucienniczak otrzymał grant Komitetu Badań Naukowych na prowadzenie badań nad produkcją antygenu HBs w roślinach. Było to 17 marca 1992 roku. Miałem przyjemność współpracować z prof. Płucienniczakiem, a nasza publikacja znajduje się wśród 10 najczęściej cytowanych oryginalnych prac dotyczących tego zagadnienia. Profesor Płucienniczak był prekursorem całego zamysłu – nie tylko ekspresji antygenów szczepionkowych w roślinach, ale także w transgenicznych zwierzętach.

Czy aktualnie stosowane szczepionki przeciwko WZW typu B nie są wystarczające? Dlaczego poszukuje się nowych rozwiązań z wykorzystaniem roślin?

Większość aktualnie stosowanych szczepionek spełnia swoje zadanie, czyli chroni przed możliwym zakażeniem. Wiadomo jednak, że niektóre osoby nie wytwarzają odporności po szczepieniu, co może wynikać m.in. z ich swoistej „konstelacji” genetycznej. Ma to związek z układem antygenów zgodności tkankowej HLA. To właśnie te obserwacje skłoniły badaczy do przeprowadzenia prac w kierunku wykorzystania dodatkowych antygenów oprócz antygenu HBs, będącego podstawowym komponentem otoczki wirus (tzw. małego antygenu S-HBs, niekiedy określanego jako HBsAg). Dodatkowe białka, tj. pre-S2 i pre-S1, oprócz małego antygenu S-HBs, są jako dodatkowe domeny wkomponowane do natywnej otoczki wirusa. Tworzą one odpowiednio średnie białko (M-HBs) – zawierające pre-S2 i małą podjednostkę – oraz duże białko (L-HBs), które zawiera odpowiednio w kolejności pre-S1, pre-S2 i małą podjednostkę. Chodzi o ekspresję dodatkowych komponentów białkowych z natywnej otoczki wirusa w celu zwiększenia efektywności odpowiedzi immunologicznej. Szczepionki, które zawierają więcej niż tylko to jedno białko w otoczce, dają lepszą odpowiedź.
Pierwotny zamysł prof. Płucienniczaka polegał na wykorzystaniu rośliny jako źródła szczepionki, która byłaby wytwarzana podobnie jak klasyczna szczepionka przeciwko WZW typu B. Jakiś czas temu zrodził się jednak pomysł, aby rośliny traktować jako źródło szczepionki podawanej doustnie. Zaczęliśmy się wtedy zastanawiać nad wykorzystaniem odpowiedniej do tego celu rośliny. Zależało nam na tym, aby wybrać roślinę jadalną, w dodatku jadalną na surowo.

Jakie są ich zalety w porównaniu z innymi systemami ekspresji genów (np. drożdże, komórki ssaków)?

Komponent szczepionkowy wytwarzany z roślin jest biosymilarem. Oznacza to, że w roślinie powstaje identyczny komponent szczepionkowy jak w systemie ssaczym czy drożdżowym. Białko, którego ekspresję uzyskuje się w roślinie, podobnie jak w hepatocycie lub w komórce drożdży, samorzutnie przyjmuje strukturę, która z wyglądu przypomina białko wirusa. Zważywszy, że takie procesy zachodzą w roślinach, które można spożywać doustnie, możemy mówić o potencjalnym źródle dużo tańszej szczepionki. Biorąc pod uwagę sposób rozmnażania roślin, masę właściwego komponentu szczepionki i potencjalną łatwość jej wytwarzania, zyskujemy cały pakiet niewątpliwych zalet. W porównaniu z drożdżami czy komórkami ssaczymi, które wymagają trudniejszych do uzyskania warunków hodowli, koszt wytworzenia takiej prototypowej szczepionki jest o wiele mniejszy.

Czy są jakieś kryteria wyboru roślin?

Stwierdziliśmy, jak już powiedziałem, że musi to być roślina, którą można zjeść w sposób naturalny na surowo. Wielu wybitnych biotechnologów, w tym m.in. Amerykanie, podejmowało próby wytworzenia w roślinach antygenów szczepionkowych, uzyskując ekspresję antygenu HBs w transgenicznych ziemniakach, a konkretnie w bulwie ziemniaka. Bulw ziemniaka nie można jednak jeść na surowo. Nieugotowane są kompletnie niesmaczne i niestrawne. Antygen szczepionkowy wytwarzany w roślinie nie może być natomiast poddawany obróbce termicznej (np. gotowaniu), ponieważ w tych warunkach białko, jakim jest antygen HBs, ulega denaturacji.
W naszej ocenie optymalnym wyborem jest sałata, którą zawsze spożywa się na surowo. Uzyskaliśmy całkiem przyzwoitą ekspresję antygenu HBs w tej roślinie i najpierw przeprowadziliśmy próby na zwierzętach, a później badanie kliniczne na małej grupie osób. Do badania wybraliśmy osoby niezaszczepione, które nie przebyły zakażenia HBV. W pierwszym podejściu 3 z 5 zakwalifikowanych osób dostały do spożycia transgeniczną sałatę wytwarzającą antygen HBs, a 2 pozostałe – zwykłą sałatę. Wyniki tych badań opublikowaliśmy w 1999 roku na łamach znanego amerykańskiego czasopisma „The FASEB Journal”. Okazało się, że wszystkie 3 osoby po spożyciu ostatniej porcji transgenicznej sałaty zaczęły wytwarzać przeciwciała anty-HBs. Sałatę podawano 2-krotnie w porcjach po 300 gram w 2-miesięcznym odstępie. 2 tygodnie po spożyciu ostatniej porcji sałaty stężenie przeciwciał anty-HBs u 2 osób osiągnęło poziom ochronny, czyli zabezpieczający przed zakażeniem, a u 1 znajdowało się poniżej tego poziomu, niemniej jednak odpowiedź była wyraźna. Oczywiście u osób, które spożyły zwykłą sałatę, nie obserwowano żadnej odpowiedzi immunologicznej.

Czy później kontynuowano te badania?

Tak, przeprowadzono kolejne badania, w których potwierdzono, że spożywanie sałaty z antygenem HBs daje odpowiedź immunologiczną. Ta odpowiedź jest niewielka – stężenie przeciwciał czasami przekracza poziom ochronny, czyli 10 jednostek (10 IU/l), a czasami mieści się poniżej tego progu. Warto wspomnieć, że podając sałatę, nie stosowaliśmy żadnych adiuwantów. Sałata zawierała tylko utworzone z antygenu HBs wirusopodobne cząstki obecne w komórkach.
Zrezygnowaliśmy jednak z pomysłu traktowania roślin jako szczepionki pierwotnej, koncentrując się na ocenie wykorzystania roślin do stworzenia szczepionek przypominających dla osób wcześniej zaszczepionych preparatem podawanym w postaci wstrzyknięcia. Nasze założenia najpierw potwierdziliśmy w badaniach na zwierzętach. Myszy zaszczepiono klasyczną szczepionką w dawce dostosowanej do małych gryzoni, tj. 0,5 µg antygenu HBs, a następnie podzielono je na trzy grupy – w grupie pierwszej ponownie podawano szczepionkę we wstrzyknięciu w dawce 0,5 µg, w grupie drugiej podawano dożołądkowo antygen HBs w materiale transgenicznej sałaty w dawce 10-krotnie mniejszej, tj. po 50 ng (0,05 µg), natomiast w grupie trzeciej podawano dożołądkowo równoważną porcję tkanki roślinnej nietransgenicznej. Po zakończeniu doświadczenia okazało się, że myszy, które były wcześniej zaszczepione i później dostawały mniejszą dawkę, odpowiedziały statystycznie tak samo jak myszy, które 2-krotnie otrzymały klasyczną szczepionkę. U myszy, które najpierw otrzymały szczepionkę w postaci wstrzyknięcia, a następnie nietransgeniczny materiał roślinny, końcowe stężenie przeciwciał anty-HBs było średnio kilka razy mniejsze niż u zwierząt powtórnie zaszczepionych „klasyczną” szczepionką lub dożołądkowo antygenem zawartym w roślinie. Zauważyliśmy, że dawka antygenu podawanego doustnie wcale nie musi być duża. Działania większości badaczy na świecie szły w kierunku uzyskania możliwie dużego stężenia antygenu w materiale roślinnym. My wykazaliśmy, że małe dawki działają tak samo dobrze, a nawet bardziej powtarzalnie niż duże.

Czy takie badania przeprowadzono też u ludzi?

Tak, takie badania przeprowadzili Amerykanie, którzy koncentrowali się na wytwarzaniu antygenu HBs w ziemniakach. Do badania zakwalifikowali oni trzy grupy pacjentów zrekrutowanych spośród pracowników służby zdrowia, a jego wyniki opublikowali w 2005 roku na łamach „Proceedings of the National Academy of Sciences”. Co ciekawe, osoby, którzy stale pracują w ochronie zdrowia, z nie do końca poznanych przyczyn gorzej reagują na szczepienia. Do badań wybrano osoby, które po szczepieniu wytworzyły przeciwciała anty-HBs w stężeniach mieszczące się w przedziale 0–100 mIU/ml. Jedna grupa spożyła 3-krotnie surowe ziemniaki transgeniczne, druga 2 razy ziemniaki transgeniczne i 1 zwykłe, natomiast trzecia tylko ziemniaki zwykłe. Odpowiedź immunologiczna w dwóch grupach, które otrzymały ziemniaki transgeniczne, była bardzo dobra. Stężenie przeciwciał zwiększyło się od kilkunastu do nawet kilkuset razy w porównaniu z wartościami wyjściowymi. Należy jednak zaznaczyć, że nie wszystkie osoby wytworzyły odpowiedź. W zależności od grupy bardzo dobrą odpowiedź na szczepionkę wytworzyło 60–80% badanych. W niektórych przypadkach stężenie przeciwciał zwiększyło się nawet do kilkunastu tysięcy jednostek.
Jak dotąd my nie przeprowadziliśmy takich badań klinicznych. Powód jest prozaiczny – są one bardzo drogie. Kiedy prowadziliśmy pierwsze badania, Polska nie była jeszcze w Unii Europejskiej. Od tego czasu bardzo się zmieniły przepisy dotyczące badań klinicznych. Dzisiaj przeprowadzenie badań drugiej i trzeciej fazy oznacza koszty, które dla nas są zupełnie nieosiągalne.

Jaka ma być ostatecznie postać szczepionki, nad którą trwają prace?

Zawsze pojawia się pytanie, co się dzieje z prototypową szczepionką podawaną doustnie. Nie raz słyszałem już opinie, że przecież to wszystko zostanie strawione. Tymczasem okazuje się, że podając doustnie antygen szczepionkowy w rozsądnej dawce (ok. 20 µg), już po 4 godzinach można potwierdzić jego obecność w krwioobiegu.
Nad postacią szczepionki pracowaliśmy intensywnie. Rośliny różnią się zawartością i poziomem czynnika szczepionkowego, który nas interesuje. W jednych roślinach jest go mało, a w innych dużo. Zależało nam na ujednoliceniu poziomu ekspresji w samych roślinach, na przykład przez rozmnażanie wegetatywne roślin produkujących dużo czynnika szczepionkowego, a następnie pozyskaniu preparatu o jednolitym składzie. Przeprowadziliśmy liofilizację materiału roślinnego. Po rozdrobnieniu i wymieszaniu otrzymujemy jednorodny materiał o określonej zawartości antygenu. W stosunkowo prosty sposób materiał ten można zmielić i uzyskać proszek, który z kolei można uformować w tabletkę o ścisłej zawartości antygenu. Szczepionka może mieć zatem postać produktu farmaceutycznego o określonych parametrach. Co więcej, opracowaliśmy też metodę jej przechowywania. Tabletki wytworzone w taki sposób można przechowywać w temperaturze pokojowej. Na świecie nie ma szczepionki, którą od momentu wyprodukowania do czasu podania pacjentowi można przechowywać w temperaturze pokojowej. Wszystkie obecnie produkowane szczepionki przechowuje się w temperaturze do około 4^oC, co stanowi pewną niedogodność. Nasz preparat można przechowywać w atmosferze azotu przez rok, zachowując jego właściwości. Jest to zatem szczepionka doustna i przechowywana w temperaturze pokojowej. Na nasze szczepionki otrzymaliśmy 4 patenty, w tym 1 europejski, który przyznano nam kilka miesięcy temu.

Czy zgłosiła się jakaś firma, która chciałaby skorzystać z patentu?

Widzi Pan, nikt się jeszcze nie zgłosił. Firmy, które wytwarzają szczepionki w sposób klasyczny, nieźle na tym zarabiają. Nasza szczepionka potencjalnie mogłaby być tańsza. Niemniej jednak przed jej wejściem na rynek należałoby przeprowadzić wiele badań klinicznych, co wiąże się z dużymi nakładami.
Naszym zdaniem preparat w takiej postaci może stanowić ciekawą alternatywę jako szczepionka przypominająca dla osób uprzednio zaszczepionych tradycyjnym preparatem podawanym we wstrzyknięciu. Myślę, że szczepionka w formie tabletki przechowywanej w temperaturze otoczenia byłaby bardzo atrakcyjna w krajach tropikalnych, gdzie niełatwo jest utrzymać temperaturę +4^oC. Przyjęcie przypominającej szczepionki w formie tabletki doustnej nie wymagałoby też zaangażowania personelu medycznego.

Czy jest koncepcja, jak dawkować takie szczepionki? Czy wystarczy pojedyncza dawka?

Jest to kwestia już obowiązującej praktyki, a w przypadku prototypowej szczepionki doustnej w postaci tabletki wymaga dalszych badań. Zgodnie z ogólnymi zaleceniami szczepionkę przeciwko WZW typu B podaje się w określonych schematach, które są różne w poszczególnych krajach. Przykładowo pełny, standardowy cykl szczepienia składa się z 3 dawek szczepionki podawanych w ciągu 6 lub 12 miesięcy, w zależności od kraju. Osoby z grupy zwiększonego ryzyka zakażenia powinny natomiast przyjmować dawkę przypominającą. Takie postępowanie należy także rozważyć, jeżeli poziom przeciwciał anty-HBs zmniejszy się do wartości <10 mIU/ml, a w niektórych krajach <100 mIU/ml. Generalnie wydaje się, że taką szczepionkę można stosować do końca życia co 5 lat – przynajmniej w pewnych grupach pacjentów. Wszystko oczywiście zależy od tego, jak dany organizm reagowałby na szczepienie.

Jakie wyniki uzyskano do tej pory (immunogenność, trwałość odpowiedzi immunologicznej)? Czy są jakiekolwiek dane dotyczące tolerancji lub występowania działań niepożądanych po zastosowaniu takich szczepionek?

Większość osób dotąd nieszczepionych na podanie pierwszej dawki szczepionki roślinnej, czyli na szczepienie pierwotne (tzw. priming) zwykle odpowiada wytworzeniem przeciwciał anty-HBs. U niektórych pacjentów zaszczepionych w ten sposób stężenie przeciwciał przekracza poziom ochronny. Zależy to od schematu szczepień i zastosowanej dawki. Nie znamy wszystkich czynników związanych z odpowiedzią na podanie rośliny produkującej szczepionkę w ramach szczepienia pierwotnego, ponieważ ich poznanie nie jest naszym celem. Zamiast dopracowywać warunki samodzielnego stosowania szczepionki roślinnej, skoncentrowaliśmy się nad użyciem jej jako dawki przypominającej, kiedy poziom odpowiedzi immunologicznej jest bardzo duży. U myszy, które dostały tylko jedną dawkę antygenu HBs w postaci szczepionki klasycznej, a nie otrzymały powtórnej dawki, poziom przeciwciał wynosi 10, 50, a nawet 100 IU. Po podaniu doustnym (dożołądkowym) szczepionki przypominającej w postaci rośliny, co warto podkreślić – bez dodatku adiuwanta – stężenie to zwiększa się nawet kilkadziesiąt razy. Amerykańskie badania kliniczne pokazują, że analogicznie jest u ludzi. Reguła jest taka – im mniejsze jest wyjściowe stężenie przeciwciał anty-HBs, tym lepsza jest odpowiedź na dawkę przypominającą. Obserwacje te potwierdzono u zwierząt, ale prawdopodobnie znajdą one potwierdzenie także i u ludzi. U osób, u których stężenie przeciwciał po szczepieniu zmniejszyło się do 0, po podaniu dawki przypominającej akceleracja odpowiedzi może być bardzo duża. Decyduje o tym kontekst immunologiczny i pewne osobnicze interakcje zachodzące między antygenem a komponentami układu immunologicznego, który dzięki pierwotnemu zaszczepieniu jest gotowy na reakcję. Mechanizm akceleracji i osobniczego zróżnicowanie skali odpowiedzi nie jest do końca poznany.
Pytając o bezpieczeństwo tego typu szczepionek, zahaczamy o kwestie dotyczące bezpieczeństwa spożywania roślin transgenicznych. Nie należę do huraoptymistów, którzy zajmowali się wytwarzaniem roślin transgenicznych. Uważam, że niektóre rośliny transgeniczne wytwarzane w celu produkcji pożywienia dla ludzi mogą stanowić zagrożenie. Jest to związane z tym, jaką cechę, jaką właściwość, jaką nową jakość ma nieść roślina transgeniczna. Twierdzenie, że wszystko wiemy o konsekwencjach spożycia rośliny transgenicznej jest bardzo dużym nadużyciem. Do zagadnień związanych z roślinami transgenicznymi należy podchodzić bardzo ostrożnie, ponieważ nie sposób przewidzieć odległych skutków ich stosowania.
Mówiąc o konkretnym przykładzie transgenicznej sałaty jako nośnika szczepionki przeciwko WZW typu B, trzeba zdawać sobie sprawę z tego, że rośliny transgeniczne z antygenami HBV zawierają także sekwencje DNA, które kodują wytwarzane w roślinie antygeny. Warto sobie zadać pytanie, czy będzie to miało jakieś konsekwencje? Wydaje się, że nie, ale czy tak jest na pewno? Odpowiedź na to pytanie wymaga badań. Powiedziałem, że nie jestem huraoptymistą, nie jestem jednak też pesymistą. Trzeba do tych spraw podchodzić z otwartą głową. Na zakończenie chciałem podkreślić jeszcze raz, to co już powiedziałem wcześniej. Nasza prototypowa szczepionka doustna anty-HBV w formie tabletki, stabilna w temperaturze pokojowej, odmienna niż wszystkie inne szczepionki, nie zawiera żadnych adiuwantów ani konserwantów. Jest to o tyle istotne, że w piśmiennictwie i nie tylko toczy się dyskusja na temat potencjalnych zagrożeń dla zdrowia pacjentów wynikających z zawartości w szczepionkach różnych dodatków, poza właściwym czynnikiem szczepionkowym.

Rozmawiał Jerzy Dziekoński

Dr Józef Kapusta jest absolwentem biologii na Uniwersytecie Adama Mickiewicza w Poznaniu (1982), doktorat obronił w 1993 r. w Instytucie Genetyki Roślin PAN. Od 2004 r. jest pracownikiem naukowym w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie. Wcześniej był zatrudniony m.in. w Instytucie Dendrologii PAN, Instytucie Genetyki Roślin PAN, Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN. Pracował na kontraktach zagranicznych: 1993–1994 (visiting professor) w Purdue University, West Lafayette USA, 1997 (honor senior research assoc.) w University Of Western Australia, Perth, Australia, 2001–2002 (visiting professor) w Thomas Jefferson University, Filadelfia, USA. Kierownik projektów badawczych finansowanych z różnych źródeł, m.in. Komitetu Badań Naukowych, NCBiR, Fundacji Nauki Polskiej. Współautor kilkudziesięciu publikacji naukowych i kilku przyznanych zastrzeżeń patentowych z zakresu wakcynologii – krajowych i zagranicznych.