1 Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji, Uniwersytet Medyczny w Białymstoku
2 Klinika Chorób Zakaźnych, Collegium Medicum Uniwersytetu Zielonogórskiego
3 Katedra i Oddział Kliniczny Chorób Zakaźnych i Hepatologii w Bytomiu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
4 Krakowska Akademia im. Andrzeja Frycza-Modrzewskiego
Pandemia COVID-19 jest wielkim wyzwaniem dla zdrowia publicznego. Jednym z przydatnych narzędzi do monitorowania występowania wirusa w populacji są badania serologiczne, które mają ograniczone zastosowanie podczas procesu diagnostycznego, zaś kluczowe w badaniach populacyjnych. Należy pamiętać, że podstawową techniką stosowaną w potwierdzaniu zakażenia SARS-CoV-2 są metody molekularne, wykrywające materiał genetyczny wirusa w wydzielinach i wydalinach chorego, zwłaszcza z błon śluzowych gardła i nosa.
1.1. Testy serologiczne w zakażeniu SARS-CoV-2
Na większość zakażeń wirusowych organizm reaguje w pierwszej kolejności wytwarzaniem swoistych przeciwciał w klasie IgM, a następnie IgG. W przypadku zakażenia SARS-CoV-2 przeciwciała IgM oraz IgG pojawiają się zazwyczaj razem we wczesnej fazie zakażenia – 2-3 tygodnie od zakażenia, a w niektórych przypadkach IgG można wykryć nawet przed IgM1.
Testy na obecność przeciwciał opierają się na wykrywaniu przeciwciał głównie w klasie IgM oraz IgG (oraz innych), które biorą udział w humoralnej reakcji immunologicznej danej osoby. Dodatni wynik wskazuje, że dana osoba przebyła zakażenie wirusem SARS-CoV-2. Testy serologiczne są przydatne do określenia w jaki sposób zakażenie rozprzestrzenia się w danej populacji. Może to być szczególnie użyteczne, ponieważ uważa się, że 80% zakażeń przebiega bezobjawowo1,2,3,4. Otwarte pozostaje pytanie czy wykryte przeciwciała zapewniają odporność i ochronę przed ponownymi zakażeniami5,6,7.
Kohmera i wsp. wykazali przydatność zautomatyzowanego wykonywania oznaczeń wykrywania przeciwciał w klasie IgG. Wówczas testy można stosować na dużą skalę. Ponadto wg Autorów testy bazujące na technice chemiluminescencji wykazały wyższą ogólną czułość niż testy oparte o metodę ELISA8.
1.2. Czułość i swoistość testów serologicznych wykrywających SARS-CoV-2
Czułość testu, czyli jego zdolność do prawidłowego wykrywania osób zakażonych, zależy od rodzaju testu i momentu wykonania badania w przebiegu zakażenia (niska czułość po kilku dniach od zakażenia vs wysoka czułość po kilku tygodniach od zakażenia)9.
Swoistość testu to stosunek wyników prawdziwie ujemnych do sumy prawdziwie ujemnych i fałszywie dodatnich. Zarówno czułość jak i swoistość testu są ważnymi wskaźnikami dokładności testu.
Według niektórych Autorów czułość testów serologicznych wykrywających zakażenie SARS-CoV-2, które lawinowo pojawiają się na rynku wynosi 86,3-100%, a swoistość 97- 99%10. Należy jednak pamiętać, że z uwagi na zmienność genetyczną wirusa, czułość i swoistość mogą wahać się w poszczególnych regionach geograficznych, zatem ocena tych parametrów powinna być odnoszona do populacji, w której ten test ma być stosowany11.
Testy oparte na antygenie nukleokapsydu N/glikoproteinie S
Wirus SARS-CoV-2 posiada cztery białka strukturalne12:
- S (ang. spike) – białko fuzyjne lub glikoproteina powierzchniowa – odpowiedzialne za interakcję z receptorem na powierzchni komórek poprzez połączenie z białkiem ACE2; proteina S posiada dwie odmienne funkcjonalnie domeny – S1 - w pobliżu końca aminowego oraz S2 - w pobliżu końca karboksylowego; część S1 ma zdolność do niezależnego wiązania się z receptorem, zaś część S2 bierze udział w fuzji błony komórkowej i wirusa;13
- E (ang. envelope) – białko płaszcza – odpowiedzialne m.in. za formowanie wirionów;
- M (ang. membrane) – białko błonowe lub membranowe – główne białko macierzy wirusa;
- N (ang. nucleocapsid) – białko nukleokapsydu – pełniące funkcję ochronną dla dużej cząsteczki RNA oraz uczestniczące w modyfikacji procesów komórkowych i replikacji wirusa.
W dostępnej literaturze pojawiają się doniesienia dotyczące przydatności oznaczania występowania przeciwciał przeciwko białkom SARS-CoV-2 u chorych. Liu i wsp. badając metodą ELISA surowice 214 pacjentów wykazali u 68,2% z nich obecność przeciwciał przeciwko białku N w klasie IgM i u 70.1% w klasie IgG oraz przeciwko białku S u 77,1% w klasie IgM i u 74,3% w klasie IgG, wykazując wyższą czułość w przypadku testów z wykorzystaniem białka S. Biorąc pod uwagę liczbę dni od wystąpienia choroby do pobrania surowicy, pacjentów podzielono na siedem grup: od 0 do 5, 6 do 10, 11 do 15, 16 do 20, 21 do 30, 31 do 35 i> 35 dni. Mediana liczby dni od wystąpienia objawów wyniosła 15 dni (zakres od 0 do 55 dni). W przypadku testu ELISA opartego na rN zaobserwowano wyraźny wzrost odsetka dodatnich wyników w klasie IgM i IgG. Odsetki dodatnich wyników w klasie IgM i IgG były niskie w okresie od 0 do 5 dni i od 6 do 10 dni, zaś w klasie IgM był wyższy niż IgG w okresie od 6 do 10 dni i następnie obniża się po 35 dni, ilustrując dynamiczny wzorzec ostrej infekcji wirusowej, w której miano przeciwciał w klasie IgG rośnie wraz ze spadkiem miana przeciwciał w klasie IgM. Odsetek dodatnich wyników badań w klasie IgM i / lub IgG wyniósł 88,9% w okresie od 11 do 15 dnia po wystąpieniu objawów i ponad 90% w późniejszych stadiach choroby. Autorzy podkreślają wzrost częstości wykrywania przeciwciał zarówno w klasie IgM, jak i IgG w miarę upływu czasu, szczególnie 35 dni po zakażeniu14.
Schnurra i wsp. badali przydatność siedmiu testów, opartych na różnych technikach (EIA, CMIA, MIA, ECLIA) i różnych konstrukcjach, wykrywających przeciwciała w zastosowaniu klinicznym i badaniach sero-epidemiologicznych. Skupiono się na ocenie czułości i porównaniu reaktywności z białkami N i S wirusa. Badano surowice 73 pacjentów z dodatnim wynikiem SARS-CoV-2 RNA z łagodnymi i średnimi objawami oraz pacjentów bezobjawowych. Próbki pobrane były po 2-3 tygodniach lub 4 tygodniach po wystąpieniu objawów i potwierdzeniu zakażenia testem PCR. W konkluzji autorzy stwierdzają, że testy oparte na antygenie nukleokapsydu N oraz testy oparte na glikoproteinie S miały podobną czułość i przydatność diagnostyczną do badań serologicznych10.
Herroelen i wsp. (praca przed uzyskaniem recenzji) porównali siedem dostępnych testów serologicznych SARS-CoV-2 opartych na różnych technologiach (ELISA, CLIA i szybkie testy) skierowanych zarówno do epitopów N- jak i S-proteinowych, w celu wykrycia różnych kombinacji izotypów przeciwciał u pacjentów z potwierdzonym przez PCR zakażeniem SARS-CoV-2, zarówno z krytycznym, jak i łagodnym przebiegiem choroby w różnych punktach czasowych15. Przeprowadzono analizę porównawczą czułości analitycznej i swoistości. Czułość oceniano w próbkach surowicy od 135 pacjentów z potwierdzonym przez PCR zakażeniem SARS-CoV-2, zarówno pacjentów hospitalizowanych z powodu zapalenia płuc, jak i personelu medycznego. Oprócz porównania z PCR, czułość oceniano porównując każdy pojedynczy test z wynikiem konsensusu przyjętego dla badanych testów. Autorzy zauważają, że w rzeczywistych warunkach klinicznych, testy serologiczne będą wykonywane najczęściej po >20 dniach po wystąpieniu objawów bądź by udokumentować przebytą infekcję u bezobjawowych pacjentów. Dla takich próbek 5 testów wykazało akceptowalną czułość >95%, podczas gdy dla jednego testu wartość czułości była znacząco niższa. Czułość 100% przy oznaczeniu <10 dnia po wystąpieniu objawów (pacjenci hospitalizowani) uzyskano tylko dla 1 testu w odniesieniu do konsensusu przyjętego dla badanych testów. Swoistość przeanalizowano na panelu 57 próbek surowic, potwierdzonych PCR, pobranych przed pandemią od pacjentów zakażonych innymi koronawirusami, innymi wirusami i z obecnością przeciwciał autoimmunologicznych. Testy 4 producentów osiągnęły w badaniu 100% swoistość. Dwa testy, które osiągnęły najniższą swoistość (91,1% i 92,9%) jako jedyne reagowały krzyżowo z HCoVs; test na którego wyniki wpływ miały interferencje z czynnikiem reumatoidalnym (RF) osiągnął swoistość 96,4% , a test który interferował z CMV IgM - 98,2%. Autorzy lepiej ocenili testy total i testy które łączą wykrywanie IgG i IgM, dla których uzyskali wyższą swoistość. Nie zaobserwowano znaczących różnic w tempie serokonwersji między ciężkimi i łagodnymi przebiegami infekcji SARS-CoV-2, ani czasem jej trwania. Odnotowano, że przeciwciała przeciwko białku S pojawiają się później niż przeciwciała przeciwko białkom N. Zaobserwowano również szybszą serokonwersję przeciwciał N w porównaniu z S1 IgG. Zauważono, że przeciwciała w klasie IgA wyraźnie poprzedzają przeciwciała w klasie IgG; IgM nie poprzedza jednak IgG. Uzyskane wyniki pozwalają sugerować, że szybkość obserwowanej serokonwersji zależy bardziej od projektu/konstrukcji testu i stosowanych rekombinowanych antygenów wirusa15.
Sun i wsp. badali przydatność oznaczania miana przeciwciał u pacjentów wymagających hospitalizacji w OIOM oraz tych, którzy takiej hospitalizacji nie wymagali. Wykazali, że jednoczasowe oznaczanie przeciwciał przeciwko białkom N i S w klasie IgM i IgG może być wykorzystywane w diagnostyce, jako że ich obecność była stwierdzona u 75% chorych już w pierwszym tygodniu. Ciekawą obserwacją jest fakt, iż u pacjentów niewymagających hospitalizacji w OIOM miano przeciwciał przeciwko białku S w klasie IgG było wyższe niż u chorych hospitalizowanych w OIOM po 3 tygodniach od zachorowania, zaś przeciwko białku N odwrotnie. Miano przeciwciał, zarówno w klasie IgM, jak i IgG wzrastało wraz z czasem od zakażenia, co może być przydatne w monitorowaniu rozwoju choroby i procesu zdrowienia16.
1.3. Zastosowanie badań serologicznych wykrywających zakażenie SARS-CoV-2
Biorąc pod uwagę wysoką zakaźność wirusa szybkie wykrycie osób bezobjawowych, a zakażonych może wpłynąć na ograniczenie szerzenia się infekcji, co ma ogromne znaczenie w kontekście zdrowia publicznego. Oszacowanie prawdziwego odsetka zakażeń SARS-CoV-2 w populacji pozwala epidemiologom lepiej modelować przebieg epidemii, pomaga też decydentom w lepszym planowaniu interwencji mających na celu kontrolę epidemii. Nadal nie wiadomo czy obecność przeciwciał przeciwko SARS-CoV-2 zapewni odporność zbiorowiskową, ale wiedza o ich występowaniu pozwoli na podejmowanie ważnych decyzji organizacyjnych w różnych miejscach pracy, zwłaszcza w placówkach ochrony zdrowia17.
Dobrym przykładem zastosowania badań serologicznych w populacjach są badania Stringhini i wsp. prowadzone w Genewie18. Autorzy włączyli do badania 2766 mieszkańców. W pierwszym tygodniu obserwowali seroprewalencję na poziomie 4,8% (95% CI 2,4–8,0, n=341), w drugim 8,5% (5,9–11,4, n=469), w trzecim do 10,9% (7,9–14,4, n=577), w czwartym do 6,6% (4,3–9,4, n=604) i w piątym tygodniu obserwacji 10,8% (8,2–13,9, n=775). U dzieci w wieku 5-9 lat oraz osób >65 roku życia przeciwciała występowały zdecydowanie rzadziej (odpowiednio 0,32%; 0,11-0,63% i 0,50%; 0,28–0,78%) niż grupie wiekowej 20-49 lat. Przeliczenie wskaźnika zakażeń pozwoliło na oszacowanie skali zakażeń na poziomie 11,6 razy wyższym niż podają oficjalne statystyki wynikające z badań molekularnych pacjentów symptomatycznych. Podobne wyniki badań populacyjnych otrzymali Silveira i wsp., którzy badając populację brazylijską obserwowali wzrost seroprewalencji w czasie19.
Należy zaznaczyć, że częstość występowania zakażeń SARS-CoV-2 jest różna, w zależności od badanej społeczności8,20,21,22,23,24,25,26,27. W środowiskach o niskiej prewalencji nawet niewielkie obniżenie swoistości testu diagnostycznego może prowadzić do znacznego obniżenia dodatniej wartości predykcyjnej testu (ang. positive predictive value - PPV), czyli prawdopodobieństwa, że wynik dodatni jest prawidłowy. Dlatego wysoka swoistość testu jest kluczowa9.
