Blaski i cienie diagnostyki serologicznej chorób zakaźnych. Cz. 6: wirusowe zapalenie wątroby typu A i B

Skróty: HAV – wirus zapalenia wątroby typu A, HBcAg – antygen rdzeniowy „c” wirusa zapalenia wątroby typu B, HBeAg – antygen rdzeniowy „e” wirusa zapalenia wątroby typu B, HBsAg – antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, HBV – wirus zapalenia wątroby typu B, HCV – wirus zapalenia wątroby typu C, HEV - wirus zapalenia wątroby typu E, WZW – wirusowe zapalenie wątroby

Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu A

Podstawą i „złotym” standardem diagnostyki wirusowego zapalenia wątroby (WZW) typu A oraz oceny stanu odporności naturalnej lub poszczepiennej są badania serologiczne w kierunku obecności przeciwciał w klasie IgM i IgG.
W diagnostyce klinicznej ostrego zapalenia wątroby zastosowanie ma tylko oznaczenie przeciwciał anty-HAV w klasie IgM. Dla praktyki istotne jest, że przeciwciała te są zawsze obecne już w fazie objawowego zapalenia wątroby, a nawet w przypadku stwierdzenia izolowanej zwiększonej aktywności aminotransferaz. Tym samym oznaczanie przeciwciał anty-HAV w klasie IgM należy do badań przesiewowych. IgM zanikają około 6–12 miesięcy od początku choroby. Przeciwciała anty-HAV w klasie IgG są markerem przebytego zakażenia lub odporności poszczepiennej, a w badaniach populacyjnych wskazują na rozpowszechnienie zakażenia. Przeciwciała IgG pojawiają się nieco później, zazwyczaj już po wystąpieniu żółtaczki i utrzymują się do końca życia. Po szczepieniu przeciwko WZW typu A są one wykrywalne po 2 tygodniach, jednak w dużo mniejszym (nawet 100-krotnie) mianie niż po przebyciu naturalnego zakażenia. W takim przypadku ostre WZW typu A można potwierdzić na podstawie serokonwersji przeciwciał anty-HAV w klasie IgG, oznaczając 2-krotnie przeciwciała anty-HAV w klasie IgG w próbkach surowicy pobranych w odstępie 14 dni. Dynamikę wytwarzania przeciwciał IgM i IgG w diagnostyce WZW typu A przedstawiono na rycinie 1. Chociaż jest to możliwe, nie zaleca się oznaczania antygenu HAV (HAV-Ag) ani HAV RNA w kale.

Ryc. 1. Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu A (opracował L. Szenborn)

Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Diagnostyka serologiczna zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest wieloparametrowa, wyjątkowo wiarygodna i pozwala określić fazę zakażenia. W żadnym innym zakażeniu nie można równie wiarygodnie ustalić, czy zakażenie ma charakter ostry, przewlekły czy przebyty ani precyzyjnie określić stanu odporności poszczepiennej (≥10 IU/l).
Antygen powierzchniowy wirusa HBV (HBsAg) jest powszechnie wykorzystywany w diagnostyce zakażeń HBV i badaniach przesiewowych (u dawców krwi i ciężarnych). HBsAg jest zwykle wykrywany jako pierwszy wskaźnik zakażenia (w 4.–12. tyg.) i poprzedza zwiększenie aktywności aminotransferaz (o 1–3 tyg.). U noworodków zaszczepionych przeciwko WZW typu B przez krótki czas 2 tygodnie po szczepieniu testy wykrywające HBsAg mogą dawać dodatnie wyniki, co nie ma praktycznego znaczenia, jeśli matka dziecka nie była zakażona HBV. Nową formą wykorzystania HBsAg w diagnostyce przewlekłego zakażenia HBV i wywołanej nim marskości jest oznaczenie jego ilości. Na podstawie badania bioptatów wątroby (metodą łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją – RT-PCR) potwierdzono ścisły związek pomiędzy liczbą cząstek cccDNA (stabilnych form replikacyjnycrh wirusa zintegrowanych z jądrami zakażonych komórek gospodarza – niemożliwych do oznaczenia w badaniach krwi) a stężeniem HBsAg w surowicy. Dzięki temu ilościowa ocena stężenia HBsAg (qHBs) stała się łatwo dostępną i tanią metodą oceny aktywności zakażenia HBV, co umożliwia dokładniejsze monitorowanie i ocenę skuteczności stosowanego leczenia.
W ostrym WZW typu B przeciwciała przeciwko HBsAg (anty-HBs) pojawiają się w surowicy 4–6 miesięcy po zakażeniu, co towarzyszy zanikaniu HBsAg i jest pośrednim dowodem na ustanie replikacji HBV. Anty-HBs utrzymują się w surowicy przez wiele lat. Między zanikiem HBsAg a pojawieniem się anty-HBs może wystąpić faza choroby bez wykrywalnych znaczników układu „s” (okno serologiczne). Czasowa/okresowa obecność przeciwciał anty-HBs może być związana z wcześniejszym podaniem osocza od dawców zaszczepionych przeciwko WZW typu B lub specjalnych preparatów hiperimmunizowanych o szczególnie dużym stężeniu swoistych przeciwciał stosowanych w profilaktyce zakażeń HBV u noworodków i pacjentów z zaburzoną odpornością. Współcześnie wykrycie anty-HBs u pacjenta jest następstwem szczepienia wykonanego w dzieciństwie lub późniejszym okresie życia. Oznaczenie tych przeciwciał pozwala potwierdzić skuteczność szczepienia oraz monitorować stan odporności przeciwko WZW typu B u pacjentów z grup ryzyka utraty takiej odporności. Aktualnie zaleca się stosowanie testów ilościowych, które pozwalają ocenić stężenie przeciwciał anty-HBs wyrażane w IU/l. W celu potwierdzenia skuteczności cyklu szczepienia przeciwko WZW typu B wystarczy jednorazowo wykazać stężenie przeciwciał anty-HBs >10 IU/l. Wiadomo, że u wszystkich zaszczepionych wraz z upływem czasu od podania ostatniej dawki szczepionki stężenie przeciwciał systematycznie się zmniejsza, co nie jest równoznaczne z zanikaniem odporności. Arbitralnie za punkt odcięcia przyjęto stężenie 10 IU/l, które było pierwszym możliwym do wiarygodnego odczytu punktem odcięcia na krzywej standardowej testów immunoenzymatycznych stosowanych w przeszłości. Jeśli od podania ostatniej dawki szczepienia minęły >3 miesiące, to stężenie anty-HBs <10 IU/l nie oznacza braku odporności. U zdrowych osób zaszczepionych przeciwko WZW typu B nie zaleca się kontrolowania stężenia przeciwciał anty-HBs. Wyjątkiem są pracownicy placówek ochrony zdrowia, którzy powinni być pewni prawidłowej odpowiedzi poszczepiennej. Zgodnie z polskim Programem Szczepień Ochronnych (PSO) osobom z niedoborami odporności, u których po szczepieniu podstawowym stężenie przeciwciał anty-HBs wynosi  10 IU/l, zaleca się rewakcynację, tj. podanie kolejnych 1–3 dawek szczepionki.
Antygen „e” HBV (HBeAg) jest podjednostką antygenu rdzeniowego HBV. W surowicy pojawia się on krótko po ujawnieniu się HBsAg i w ostrym WZW typu B utrzymuje się przez 3–9 tygodni. Jego obecność w surowicy odzwierciedla intensywność replikacji HBV i dużą zakaźność chorego dla otoczenia. HBeAg u ciężarnych zakażonych HBV wskazuje na duże ryzyko zakażenia noworodka w przypadku braku profilaktyki (szczepienie + immunoglobuliny). HBeAg zanika zawsze przed HBsAg. Niekiedy, w przypadku mutacji HBV, mimo występowania replikacji HBV nie stwierdza się obecności HBeAg w surowicy.
Przeciwciała przeciwko HBeAg (anty-HBe) są wykrywalne po zaniku HBeAg i zwykle utrzymują się jeszcze przez kilka lat po serokonwersji. Pośrednio są one wskaźnikiem zmniejszonej zakaźności dla otoczenia oraz lepszego rokowania. Obecnie czulszą metodą oceny rokowania jest ilościowa ocena HBsAg oraz HBV DNA.
Antygen rdzeniowy „c” HBV (HBcAg) nie jest wykrywalny w surowicy, w której rutynowo bada się obecność przeciwciał anty HBcAg, i to wyjątkowo, w przypadku diagnostyki w kierunku WZW typu B, w klasie IgM i IgG. Anty-HBc IgM są pierwszymi przeciwciałami, które można wykryć w surowicy pacjenta zakażonego HBV (już 2 tyg. po pojawieniu się HBsAg). Na początku ostrego WZW typu B osiągają one duże stężanie i zanikają stopniowo w ciągu 6 miesięcy. Ich obecność stanowi podstawę do rozpoznania ostrego WZW typu B, jednak mogą być one także wykrywalne w okresie zaostrzenia przewlekłego WZW, towarzysząc serokonwersji w układzie HBe. Anty-HBc IgG pojawiają się kilka tygodni po anty-HBc IgM i utrzymują się przez wiele lat, wskazując na kontakt z wirusem HBV. U osób anty-HBs dodatnich pozwalają one odróżnić odporność poszczepienną od naturalnej. Dodatkowo w przypadku zaniku HBsAg i anty-HBs mogą one stanowić jedyny wskaźnik przebytego zakażenia HBV. W związku z tym anty-HBc zawsze należy oznaczyć przed planowanym leczeniem immunosupresyjnym (chemioterapia, przeszczepy narządów, leczenie biologiczne), które może być przyczyną reaktywacji ukrytego zakażenia HBV. Różne konstelacje markerów zakażenia HBV i ich interpretację przedstawiono w tabeli, a występowanie wskaźników, jako funkcji czasu w ostrym i przewlekłym okresie choroby, przedstawiono odpowiednio na rycinie 2. i 3.
W nadzorze specjalistycznym nad pacjentami zakażonymi HBV stosuje się nieserologiczne metody diagnostyczne wykorzystujące techniki molekularne. Powszechnie oznacza się HBV DNA, rzadziej polimerazę DNA (pDNA). Markery te pojawiają się w surowicy 2–4 tygodni przed zwiększeniem wartości aminotransferazy alaninowej (AlAT), tuż przed wystąpieniem objawów chorobowych, i zanikają lub utrzymują się w zależności od przebiegu zakażenia.

Ryc. 2. Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B z ostrym przebiegiem choroby (rzadko) (opracował L. Szenborn)

Ryc. 3. Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B z przewlekłym przebiegiem choroby (opracował L. Szenborn)

Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C

Diagnostyka serologiczna zakażenia wirusem HCV ma znaczenie jako badanie przesiewowe. Są to testy jakościowe. Należy stosować tylko test trzeciej generacji, w którym do wykrywania przeciwciał anty-HCV użyto peptydów i rekombinowanych antygenów będących odpowiednikami białek rdzenia wirusa HCV. Stwierdzenie w surowicy krwi obecności przeciwciał anty-HCV nie stanowi podstawy do rozpoznania aktualnego zakażenia HCV, a tylko świadczy o kontakcie z wirusem HCV. Wynik dodatni należy zweryfikować, powtarzając badanie 2-krotnie w kolejnej próbce krwi. Współcześnie zakażenie HCV monitoruje się przede wszystkim ilościowym oznaczaniem HCV RNA. Wyniki obu testów, tj. anty-HCV i HCV RNA, mogą być rozbieżne, na przykład we wczesnej fazie wiremii (bez przeciwciał) lub po jej ustąpieniu (obecność przeciwciał). W zakażeniu HCV przeciwciała mogą być też nieobecne lub występować w bardzo małym mianie. W celu potwierdzenia lub wykluczenia zakażenia HCV należy wykonać HCV RNA albo badanie metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Czasami wiremia może mieć wartość poniżej czułości metody, a u małych dzieci zakażenie HCV bywa związane z niecałkowitą ekspresją HCV RNA oraz występowaniem zjawiska przerywanej obecności wirusowego RNA, dlatego konieczne jest powtarzanie badania HCV RNA. Stwierdzenie przeciwciał anty-HCV nigdy nie świadczy o stanie odporności badanego, a wykrywane przeciwciała mają jedynie znaczenie detekcyjne oraz zastosowanie przesiewowe. Dynamikę wytwarzania przeciwciał anty-HCV w diagnostyce ostrego i przewlekłego WZW typu C na tle innych metod diagnostycznych przedstawiono na rycinie 4. i 5.

Ryc. 4. Serologiczne i biochemiczne markery zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C oraz HCV RNA u osób, u których doszło do eliminacji wirusa (opracował L. Szenborn)

Ryc. 5. Serologiczne i biochemiczne markery zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C oraz HCV RNA u osób z zakażeniem przewlekłym (opracował L. Szenborn)

Badanie anty-HCV jest nieprzydatne w przesiewowej diagnostyce zakażeń u noworodków i niemowląt urodzonych przez matki zakażone HCV, ponieważ w organizmie dziecka wyjątkowo długo (do 18. mż.) utrzymują się w wykrywalnych stężeniach przeciwciała anty-HCV pochodzące od matki. U dzieci urodzonych przez matki HCV dodatnie należy 2-krotnie oznaczyć HCV RNA oraz >18. miesiąca życia anty-HCV. Przed ewentualnym rozpoczęciem leczenia WZW typu C (które można rozpocząć dopiero po ukończniu 3. rż. – przyp. red.) należy koniecznie oznaczyć genotyp wirusa HCV, ponieważ poszczególne genotypy mają zróżnicowane wymagania terapeutyczne.

Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu E

W różnicowaniu zapalenia wątroby, zwłaszcza po pobycie w strefie subtropikalnej oraz krajach endemicznych, trzeba również uwzględnić zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu E (HEV), które przebiega podobnie jak HAV.
Podstawę rozpoznania stanowi wykrycie antygenu HEV w surowicy lub w kale (ryc. 6.), a w celu jego potwierdzenia wykonuje się badanie HEV RNA lub PCR. W badaniach przesiewowych w ostrym WZW poszukuje się anty-HEV IgM. Natomiast wykrycie anty-HEV IgG potwierdza przebycie objawowego lub bezobjawowego zakażenia.

Ryc. 6. Diagnostyka zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu E (opracował L. Szenborn)