Blaski i cienie diagnostyki serologicznej chorób zakaźnych. Cz. 5: borelioza z Lyme

Skróty: ELISA – test immunoenzymatyczny, PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy

Wprowadzenie

Borelioza z Lyme to wieloukładowa choroba zakaźna wywoływana przez krętki z gatunku Borrelia burgdorferi sensu lato. Jest to najczęstsze zakażenie przenoszone przez kleszcze na półkuli północnej. Rocznie w Polsce rejestruje się >20 000 zakażeń. Chociaż od >30 lat dysponujemy skutecznymi metodami rozpoznawania i leczenia, u niektórych pacjentów choroba ta wzbudza niepokój i obawy potęgowane nieprawdziwymi informacjami publikowanymi głównie na forach internetowych. W niniejszym artykule omówiono laboratoryjne metody rozpoznawania boreliozy z Lyme, a także najczęstsze błędy i pułapki w zlecaniu testów diagnostycznych oraz ich interpretacji.

Badania serologiczne – podstawowa laboratoryjna metoda diagnostyczna

Zgodnie z amerykańską, europejską i polską definicją, podstawą rozpoznania boreliozy z Lyme jest obecność objawów klinicznych.^1,2 Wyniki przeglądu aktualnych europejskich i amerykańskich wytycznych dotyczących rozpoznawania boreliozy z Lyme wskazują, że są one zgodne na każdym etapie diagnostyki zakażenia. Według wszystkich wytycznych rozpoznanie laboratoryjne powinno się opierać na dwuetapowej diagnostyce serologicznej na wszystkich stadiach rozwoju zakażenia, z wyjątkiem wczesnej, zlokalizowanej postaci, tj. rumienia wędrującego (erythema migrans – EM).³
Zgodnie z zaleceniami Center for Diseases Control and Prevention (CDC), European Union Concerted Action on Risk Assesment in Lyme Boreliosis (EUCALB) oraz Polskiego Towarzystwa Epidemiologów i Lekarzy Chorób Zakaźnych (PTEiLChZ) dwuetapowa diagnostyka laboratoryjna boreliozy z Lyme polega na:

• w pierwszej kolejności – oznaczeniu stężenia (lub miana) swoistych przeciwciał w klasie IgG lub IgM za pomocą testów serologicznych o wysokiej czułości (test immunoenzymatyczny – ELISA, test chemiluminescencyjny – CLIA) – metoda ilościowa
• w drugiej kolejności – weryfikacji wyników dodatnich lub wątpliwie dodatnich metodą western blot – metoda jakościowa.

Metody te należy stosować tylko u pacjentów z objawami klinicznymi przypominającymi boreliozę z Lyme. Wynik można uznać za dodatni, jeśli oba testy są dodatnie.^2,4,5

Wczesne stadium boreliozy z Lyme

Większość wytycznych opisuje rumień wędrujący (objaw patognomoniczny) jako zmianę skórną pojawiającą się w ciągu kilku dni lub tygodni w miejscu po ukłuciu kleszcza. Rumień wędrujący (również rzadko występujący rumień mnogi) nie wymaga potwierdzenia laboratoryjnego, gdyż jest to charakterystyczny objaw boreliozy z Lyme. W takim przypadku rozpoznanie może ustalić lekarz pierwszego kontaktu bez udziału lekarza chorób zakaźnych. Wystąpienie zmian skórnych w ciągu <24–48 h, które zanikają w ciągu kilku dni, nie uprawnia do rozpoznania boreliozy z Lyme. Przeciwciała dla Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), czynnika etiologicznego boreliozy z Lyme, są wykrywalne 2–4 tygodni po pojawieniu się rumienia. Badanie takie jest pomocne w przypadku stwierdzenia nietypowego rumienia, jednak należy je wykonać nie wcześniej niż 2 tygodnie po jego pojawieniu się (p. tab.). Niektóre wytyczne zalecają też wykonanie badania w przypadku wystąpienia rumienia poza sezonem aktywności kleszczy lub na obszarze, na którym kleszcze nie występują. Bardzo rzadkim, ale typowym objawem wczesnego zakażenia rozsianego (0,3–3% przypadków), jest chłoniak limfocytowy skóry, inaczej ziarniniak chłonny (lymphocytoma/Borrelial lymphoma). Jego rozpoznanie należy potwierdzić w badaniu serologicznym (p. tab.).^6-8

Stadium wczesne rozsiane boreliozy z Lyme

W drugim stadium (zakażenie rozsiane) choroby dochodzi do zakażenia wielu narządów i układów, pojawiają się dolegliwości ze strony ośrodkowego lub obwodowego układu nerwowego, układu kostno-stawowego lub układu krążenia.^6-8

Neuroborelioza

Neuroborelioza rozwija się w ciągu kilku tygodni od zakażenia. Najczęściej dochodzi do jednostronnego lub obustronnego porażenia nerwu VII, porażenia korzeni nerwowych lub pojedynczych nerwów obwodowych, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych (meningitis), zapalenia mózgu (encephalitis) lub zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego (encephalomyelitis). Potwierdzeniem neuroboreliozy jest stwierdzenie wewnątrzoponowej produkcji immunoglobulin klasy IgM i IgG dla B. burgdorferi poprzez określenie stosunku mian przeciwciał w surowica i płynie mózgowo-rdzeniowym (PMR), który stanowi tzw. złoty standard. Ograniczeniem tego badania jest jednak jego mała czułość na bardzo wczesnym etapie choroby i utrzymywanie się wewnątrzoponowej syntezy przeciwciał przez długi okres po leczeniu. European Society for Clinical Micro-biology and Infectious Diseases (ESCMID) wskazuje, że czułość diagnostyczna testów serologicznych wykrywających syntezę przeciwciał wynosi około 80%, jeśli choroba trwa krótko (<6–8 tygodni), i prawie 100%, jeśli trwa dłużej. Większość wytycznych zaleca badanie PMR, w którym zwykle stwierdza się obecność limfocytów, komórek plazmatycznych, monocytów (cytoza do kilkuset komórek) oraz zwiększone stężenie białka, co potwierdza proces zapalny. W odniesieniu do wykrywania przeciwciał w surowicy większość zaleceń sugeruje, aby w przypadku negatywnego wyniku badania serologicznego w surowicy i utrzymującego się podejrzenia neuroboreliozy, po 2–4 tygodniach oznaczyć obecność przeciwciał w surowicy w celu wykrycia potencjalnej serokonwersji. Zmiany w układzie nerwowym są widoczne w tomografii komputerowej i rezonansie magnetycznym w postaci wielu małych (do 5 mm), punktowych lub liniowych obszarów o nasilonej demielinizacji lub glejozy (zastępowanie obumarłych komórek nerwowych przez komórki glejowe, które, wypełniając ubytki, tworzą tzw. bliznę astrocytarną).^9,10

Borelioza stawowa

Inną częstą postacią drugiego stadium boreliozy z Lyme jest borelioza stawowa (Lyme arthritis) związana z zajęciem układu kostno-stawowego. W przebiegu tej postaci najczęściej obserwuje się ból mięśniowo-stawowy, pojawiający się już w okresie boreliozy wczesnej, który stopniowo się nasila, obejmując 1 lub 2–3 stawy (rzadko wielu). Stopniowo rozwija się stan zapalny, który można uwidocznić na zdjęciu rentgenowskim (RTG) kilka miesięcy po wystąpieniu pierwszych objawów. W badaniu przedmiotowym stwierdza się obrzęk, bolesność i zaczerwienienie. Stan zapalny zwykle obejmuje stawy kolanowe, a rzadziej skokowe, łokciowe, ramienne i biodrowe. Może im towarzyszyć zapalenie torebek stawowych i przyczepów ścięgnistych.
Większość wytycznych zaleca wykonanie testu serologicznego i badanie ogólne płynu stawowego (zwiększona liczba komórek z przewagą granulocytów w rozmazie). Na początku choroby niektórzy pacjenci mogą być seronegatywni, ale w późniejszej fazie zawsze wykrywa się przeciwciała dla B. burgdorferi klasy IgG w dużym stężeniu i wiele frakcji przeciwciał w badaniu western blot. Dodatni wynik badania metodą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z płynu stawowego lub z błony maziowej zwiększa pewność diagnostyczną (metoda uzupełniająca).^6-8

Najczęstsze błędy i pułapki w zlecaniu testów diagnostycznych oraz ich interpretacji

Badania serologiczne

Obecnie badania serologiczne w kierunku boreliozy z Lyme można wykonać w wielu laboratoriach w Polsce. Na wyniki badań ogromny wpływ ma odpowiedni dobór antygenów diagnostycznych – najczęściej w teście ELISA stosuje się antygeny z całej komórki krętka, a w metodzie western blot antygeny rekombinowane, co wydaje się być najlepszym schematem.¹⁰ Interpretacja wyniku badania metodą western blot powinna uwzględniać ustalone kryteria przyjęte dla antygenów użytych w danym teście zgodnie z zaleceniami ośrodków referencyjnych, a nie według kryteriów firm komercyjnych produkujących testy. Potwierdzeniem rozpoznania boreliozy z Lyme jest wykrycie określonej liczby frakcji przeciwciał dla swoistych antygenów krętków. Obok rekombinantów najczęściej stosuje się antygen z lizatu komórkowego B. afzelii – genogatunku najpowszechniej występującego w Europy. Przyjmuje się, że w zależności od antygenu wynik immunoblotu w klasie IgM jest dodatni, jeżeli przeciwciała reagują z określoną liczbą frakcji antygenów. Jest to co najmniej jeden prążek: VlsE, p39, OspC, p18 w przypadku użycia lizatu B. afzeli lub silna reakcja z antygenem p41 (flagelina). W przypadku antygenów rekombinowanych konieczne jest wykazanie co najmniej 2 prążków spośród: VlsE, p41 (int), p39, OspC i p18, lub silna reakcja z OspC. Dla przeciwciał klasy IgG konieczne jest stwierdzenie co najmniej dwóch prążków VlsE p83/100, p58, p43, p39, p30, OspC, p21, p18 (DbpA), p14, kiedy antygen stanowi lizat B. afzeli, lub co najmniej dwa prążki spośród: VlsE p83/100, p58, p41(int), p39, OspC i p18 (DbpA) dla antygenów rekombinowanych.^12,13
Większość antygenów diagnostycznych zidentyfikowano i scharakteryzowano pod koniec lat 90. XX wieku.^11,12 Obecnie ich rekombinowane odpowiedniki są stosowane w testach typu line-blot. Niestety w klasie IgM mamy do czynienia z dużą liczbą wyników fałszywie dodatnich zarówno w teście immunoenzymatycznym, jak i potwierdzającym, na co szczególną uwagę muszą zwracać diagności i lekarze. Należy także pamiętać, że mają one znaczenie tylko w pierwszych 3 miesiącach od zakażenia. Rozpoznanie boreliozy na podstawie dodatniego wyniku przeciwciał w klasie IgM po tym czasie jest błędem.^3,5,11
Zbyt wcześnie wykonane badania dają wyniki fałszywie ujemne. Wykonanie tylko badania wstępnego lub tylko badania potwierdzającego nie ma wartości diagnostycznej. Częstą praktyką jest wykonywanie tylko testu potwierdzającego. Jednak takie postępowanie jest nieprawidłowe, ponieważ nie daje informacji na temat stężenia (lub miana) swoistych przeciwciał krążących we krwi (poniżej czy powyżej wartości odcięcia [cut-off]).^6,11

Hodowla, wykrywanie materiału genetycznego krętków

Diagnostyka oparta na bezpośrednim wykrywaniu czynnika etiologicznego boreliozy ma dużo mniejsze znaczenie niż badania serologiczne. Hodowla krętków wymaga bardzo bogatego podłoża BSK-H, w skład którego wchodzi >60 składników, takich jak aminokwasy, witaminy i elektrolity, a dodatkowo jest ono wzbogacone surowicą króliczą (6%). Inokulum nie może być mniejsze niż 10 komórek bakteryjnych, a na ostateczny wynik trzeba czekać kilka tygodni. Badanie to wykonują jedynie wyspecjalizowane laboratoria. Najczęściej dodatnie wyniki posiewów uzyskuje się z bioptatów skóry pobranych z rumienia (ok. 50–85%), rzadziej z PMR (ok. 10%), z chrząstki stawowej. Pojedyncze izolacje uzyskuje się z płynu stawowego i krwi.^1,3,4,11
Nieco większe znaczenie ma wykrywanie materiału genetycznego krętków metodami umożliwiającymi wielokrotne powielanie określonych, charakterystycznych dla B. burgdorferi fragmentów genomu, do których należą: PCR, Real-time PCR, qPCR (qualitative PCR), nPCR (nested PCR) lub FEP PCR (Fluorescent End-Point PCR). Mimo niewątpliwych zalet, posiadają one jednak szereg ograniczeń. Do najważniejszych należy wybór materiału do badania i stadium choroby, w którym pobrano materiał. DNA krętków częściej jest wykrywalne w ostrej fazie choroby niż w późnej. Na wynik badania może wpływać obecność w badanym materiale DNA pochodzącego z komórek gospodarza. Wymienione ograniczenia mogą być przyczyną wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych. Wyniki badania istotnie zależą także od metody ekstrakcji DNA, ponieważ w przypadku niewielkiej liczby bakterii w badanym materiale konieczne może być pobranie jego większej objętości. Materiał genetyczny krętka najczęściej wykrywa się w wycinku skóry pobranym z rumienia lub z obszaru zmian przewlekłego zanikowego zapalenia skóry (ok. 50–85%), a także z chrząstki stawowej (50–80%), a rzadziej z PMR (ok. 10%). Należy podkreślić, że negatywny wynik hodowli i/lub PCR nie wyklucza aktywnej infekcji. ^1,3,4,11

Inne testy diagnostyczne

Obecnie nie ma innych wiarygodnych i istotnych klinicznie testów, które można stosować w diagnostyce boreliozy z Lyme.
Do czasu walidacji i oceny w niezależnych laboratoriach nie należy stosować testów komórkowych, takich jak test transformacji limfocytów (LTT) lub testy aktywacyjne. Dostępne dane nie potwierdzają ich wysokiej czułości i swoistości diagnostycznej.
Stosowanie takich testów, jak ocena liczebności subpopulacji limfocytów CD57, biorezonans, oznaczanie kompleksów immunologicznych (KKI), mikroskopia ciemnego pola lub kontrastu fazowego jest nieuzasadnione, ponieważ nie potwierdzono ich swoistości.
CXCL13 to chemokina wykrywana w dużych stężeniach w PMR u pacjentów z neuroboreliozą, które zmniejsza się w trakcie antybiotykoterapii. Jednak CXCL13 występuje także w przebiegu innych chorób, takich jak kiła układu nerwowego, zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności czy chłoniaki. Niektórzy uważają, że marker ten może być przydatny w bardzo wczesnej fazie zakażenia (<2 tygodni),^9,11 jednak według PTEiLChZ badanie to nie jest zalecane w diagnostyce boreliozy.⁵

Badanie kleszcza na obecność B. burgdorferi

Badanie kleszcza na obecność krętków B. burgdorferi (również innych patogenów przenoszonych przez te pajęczaki) nie ma znaczenia diagnostycznego i nie jest zalecane przez klinicystów i towarzystwa naukowe. Samo wykrycie DNA w kleszczu nie oznacza rozpoznania boreliozy z Lyme i nie stanowi wskazania do zastosowania antybiotyku.^3,5,9,11
Uważa się, że minimalny czas niezbędny do zakażenia człowieka podczas żerowania na skórze wynosi 24 godziny. Jeśli jest on dłuższy, to ryzyko rozwinięcia się pełnoobjawowej boreliozy z Lyme wynosi 5,2% (>4 dni żerowania). Wykrycie DNA Borrelia burgdorferi s.l. w kleszczu zwiększa ryzyko do 6,7%. Należy jednak pamiętać, że nawet jeśli wynik badania był ujemny, to nadal istnieje ryzyko zakażenia, choć jest ono dużo mniejsze (do 1,4%).¹⁴

Badania przesiewowe w kierunku boreliozy

Nie istnieje pojęcie „boreliozy bezobjawowej”, dlatego nie zaleca się wykonywania badań w kierunku boreliozy u osób zdrowych, u których nie obserwuje się żadnych objawów klinicznych. Należy pamiętać, że u około 10% populacji polskiej wykrywane są przeciwciała w teście ELISA (badania własne). Jeszcze większy odsetek osób serododatnich obserwuje się w grupach ryzyka zakażenia ze względu na wykonywany zawód lub miejsce zamieszkania. Przeciwciała IgM i/lub IgG dla antygenów Borrelia wykazano na przykład u 22% leśników w nadleśnictwach Dolnego Śląska, u 55% leśników i 28% rolników na terenach Podlasia i Polesia Lubelskiego, u 30–45% leśników w województwie podkarpackim oraz u 21% w województwie świętokrzyskim.^15-17 Wynik dodatni nie świadczy o chorobie, a jedynie wzbudza niepokój i naraża pacjentów na niepotrzebne koszty.

Podsumowanie

Boreliozę z Lyme można rozpoznać w przypadku stwierdzenia charakterystycznych objawów klinicznych opisanych w definicjach boreliozy z Lyme oraz po analizie narażenia na ukłucia kleszcza i wykluczeniu innych chorób. Nigdy nie należy się opierać tylko na wynikach testów laboratoryjnych. Pacjentom z typowym rumieniem można od razu zlecić leczenie, ponieważ nie wymagają oni potwierdzenia rozpoznania w testach serologicznych. Wykrycie przeciwciał przeciwko B. burgdorferi jest z kolei konieczne do potwierdzenia klinicznego rozpoznania boreliozy z Lyme u pacjentów z innymi objawami zakażenia niż typowy rumień wędrujący. Obecnie w ramach rutynowego postępowania zaleca się dwuetapową diagnostykę serologiczną, która charakteryzuje się największą czułością. W szczególnych sytuacjach, takich jak nietypowe objawy skórne, podejrzenie wczesnej neuroboreliozy czy zapalenie stawów, stosuje się metody molekularne (wykrywanie DNA patogenu). Inne metody badań nie są zalecane ze względu na brak standaryzacji.